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脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高以及并发症多的特点,同冠心病、癌症并列为威胁人类健康的三大疾病,主要分为缺血性和出血性脑卒中两种类型。出血性脑卒中是致死和致残率最高的脑血管病,且愈后多有严重的神经功能障碍等后遗症。研究发现,Ⅳ型胶原蛋白基因a1(a1 type IV collagen,COLA4A1)、CCM1/2/3、HTRA1、FOXC1和NOTCH3等血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)功能相关的基因突变与脑卒中密切关联。研究表明BBB渗漏是脑血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)和脑卒中发生的标志,而有趣的是大部分与脑卒中相关的基因都参与了BBB的发育和维持。BBB是内皮细胞(Endothelial cells,ECs)、周细胞、星形胶质细胞以及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)等构成的物理及生理屏障,且ECs的紧密连接和周细胞覆盖对BBB完整性至关重要。其中周细胞主要起源于神经嵴干细胞(Neuralcrest stem cell,NCSCs)和间充质细胞,而NCSCs发育相关基因的突变是否与脑卒中相关目前研究并不清楚。目前,斑马鱼基因测序工程已完成,与人类基因组地相似性高达87%,且与人类有着相似的病理特征和信号传导通路。斑马鱼本身拥有和人类似的血脑屏障,且斑马鱼的血脑屏障伴随着脑血管新生开始,大概在3.5 dpf基本形成。因此,本课题以多种转基因斑马鱼为研究对象,通过构建脑出血和BBB实验模型,筛选脑出血相关的NCSCs突变基因,并重点探讨bmp3在斑马鱼脑出血过程中的作用。基于NCSCs发育相关的突变基因探讨脑出血现象,为进一步认识出血性脑卒中的发生发展过程提供新的视角,同时为该领域临床干预和新药研发提供新的思路和潜在靶点。本文主要研究内容及结果如下:(1)构建斑马鱼脑出血-血脑屏障的实验模型。本课题以Tg(fli1:GFP)转基因斑马鱼为研究对象,通过胚胎显微注射col4a1-MO构建了白光视野可观察的脑出血实验模型。针对后续实验研究,以Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)转基因斑马鱼为研究对象,构建了荧光视野可观察的脑出血实验模型。以上述结果为基础,通过Tg(flk1:GFP)转基因斑马鱼在5 dpf用Evans-blue进行斑马鱼活体染色。结果显示,可在荧光视野下观察到BBB渗漏现象,但对BBB渗漏情况不能进行定量。为了构建更为理想的实验模型,我们采用经典追踪剂Dextrane-Rhodamine和DAPI,并在4.5 dpf将两者混合物注射到斑马鱼胚胎躯干静脉中。结果显示,不仅可以观察到BBB渗漏现象,而且还可以通过DAPI的量化对BBB渗漏情况进行定量。因此,后者是目前构建的脑出血-血脑屏障最理想的实验模型。(2)脑出血相关的NCSCs突变基因的筛选及验证。1)通过全基因组关联研究(Genome-wide association study,GWAS)方法分析了部分NCSCs相关基因与出血性脑卒中的关联性,并挑选出TFAP2a、MSX1、COL8A1、DKK1、DKK2和BMP3进行验证;2)通过斑马鱼脑出血模型进行后续验证。验证结果表明,tfap2a、msx1、col8a1和bmp3实现内源性敲降后,斑马鱼胚胎发生明显的脑出血现象;msx1和dkk2实现内源性敲降后,发生明显的眼出血现象。(3)bmp3在斑马鱼脑出血中作用的初步研究。1)通过斑马鱼脑出血-血脑屏障的实验模型对bmp3在BBB中的作用进行观察。结果表明,bmp3基因功能的缺失导致斑马鱼胚胎的脑出血和BBB渗漏。2)采用整胚免疫荧光染色对BBB中ACTA2表达的进行观察。结果表明,bmp3基因功能的缺失减少了周细胞在BBB中的覆盖。3)以Tg(BRE:GFP)转基因斑马鱼为研究对象,观察bmp3对斑马鱼中BRE表达的影响。结果表明,bmp3的敲降会影响斑马鱼脑中BMP信号的模式和活性。4)以Tg(Sox10:GFP)转基因斑马鱼为研究对象,观察bmp3对斑马鱼脑中NCSCs发育的影响。结果表明,bmp3的敲降会导致斑马鱼脑中NCSCs数目的减少。综合上所述,我们成功建立了斑马鱼脑出血-血脑屏障实验模型,并以此为模型筛选脑出血相关的NCSCs突变基因,如tfap2a、msx1、col8a1和bmp3等。且进一步研究发现,bmp3可能通过调控NCSCs向脑周细胞的转化,从而影响BBB功能完整性,并有可能与出血性脑卒中相关。因此,本文研究结果为出血性脑卒中疾病新药的研发提供了新的潜在靶点,可缩短新药研发时间,并有可能增加药物研发成功的机率。