研究背景：糖尿病是一种普遍的复杂代谢性疾病,WHO最近公布的数据表明：在全球成人人口中估计有171,000,000例糖尿病病人的发病率,到2025年将达到3亿人,糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病。它可导致严重的长期的微血管及大血管并发症,并由此带来较高的致病率与死亡率。我国人口患病率已接近5%,与发达国家类似。尽管在世界范围内糖尿病人口中,1型糖尿病的比例只占到10%,但其因持续增长的发病率(欧洲高达41/100,000人口／年、北美高达25/100,000人口／年)而成为主要的全球性健康问题。1型糖尿病是T淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病,可导致β细胞破坏及胰岛素分泌的减少。其特征表现为抗胰岛细胞抗体的出现(目前诊断1型糖尿病的最佳标准)、严重的胰岛素缺乏及表明胰腺β细胞被自身免疫破坏的证据。1型糖尿病的标准治疗方案为严格控制的建立在严密血糖检测基础上的各种胰岛素注射治疗。但是皮下注射不能准确模仿正常胰岛素分泌的生理过程,所以在治疗过程中还需要严格的饮食控制,同时也增加了并发严重低血糖的风险。当前,达到并维持正常血糖,同时避免低血糖风险的唯一途径,就是胰岛替代治疗：胰腺移植及胰岛移植。β细胞替代疗法在经过选择的1型糖尿病人中,已经部分的成功逆转了肾及神经系统的长期并发症。在最近的20余年,胰腺移植治疗1型糖尿病取得了较好的效果。同时,关于胰岛移植的研究已经取得了显著的成果。首先,人胰岛移植治疗糖尿病已有成功的报道：Shapiro等报道了接受胰岛移植的36例病人中,有21例(58%)在随后的1年里脱离了胰岛素治疗,其中有5例病人彻底脱离胰岛素治疗的时间维持了2年。Ryan等在65例接受了胰岛移植病例的5年研究中,报道了脱离胰岛素依赖的中位时间为15个月。实际上,有大约10%的病例保持了长期的脱离胰岛素依赖状态；第二,胰腺保存技术的改进、胰岛分离率的提高以及合理的免疫抑制剂方案和抗炎治疗的应用,使胰岛移植取得了同胰腺移植相近的效果；第三,实验表明,干细胞分化的胰岛细胞能够逆转糖尿病,这预示着胰岛移植有着潜在无限的组织来源。胰岛细胞移植已被证实可以有效降低血糖,使糖尿病患者由胰岛素依赖型转为非依赖性,或减少胰岛素的用量,并可在很大程度上改善患者依靠胰岛素治疗时不能防止的糖尿病慢性并发症；此外胰岛细胞移植还具有安全、基本无创伤性、并发症少及易重复多次移植的特点。胰岛移植被认为是彻底治愈1型糖尿病并阻止其并发症进展的最终方案。胰岛的移植量至少要达到全胰的10%-20%才能维持正常血糖和糖基化血红蛋白水平。胰腺胰岛的数量仅占胰腺细胞总数的2%,并且很难从大块的胰腺外分泌腺体组织中分离及纯化。由于胰岛分离纯化过程中的损伤,分离时间较长,以及移植后短时间内没有血供建立,造成了胰岛凋亡和死亡。一般需2到4个供体的胰岛才能使患者完全脱离胰岛素,胰岛移植登记合作机构在2006年度报告中,报道了自1999年到2005年期间,共进行了225例胰岛移植。约2/3的受体1年内脱离了胰岛素依赖(定义为至少14天不需胰岛素干预治疗),而在第2年该比例下降到1/3。1型糖尿病未来的主要治疗目标是促进β细胞的再生,可以由β细胞的自我复制或利用干细胞技术进行祖细胞的定向分化从而逃避自身免疫并促进内源性胰岛素的分泌来实现。目前国内外学者正积极进行以下几个方面的研究：①改进胰岛的分离技术,以获得足够数量和高质量的胰岛。②研究对胰岛没有毒性的免疫抑制方案。③利用干细胞技术和异种移植来克服胰岛来源短缺。如能延长胰岛体外培养时间并使其保持良好的功能,将能大大减少移植所需的胰岛用量,从而突破胰岛移植数量受限的的瓶颈,使糖尿病的治疗获得新的发展。由于间充质干细胞能够诱导免疫耐受,并且在体外具有向胰岛素分泌细胞定向分化的潜力,上述特性可以达到1型糖尿病的主要治疗目标,所以其作为1型糖尿病一种治疗选择的代表而引起人们的关注。MSC最早是从骨髓分离出的成体干细胞。1976年Friedenstein发现骨髓单核细胞在塑料培养皿中形成的贴壁细胞易于提取、分离及扩增,可在一定条件下向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化,并且在体外扩增数十代后仍能保持其多向分化潜能,并且在损伤环境下还可以诱导扩增,参加组织修复或者再生反应,因此这类细胞被命名为"MSC"。MSCs能分泌多种造血及非造血生长因子、白介素和趋化因子,如M-CSF、SCF、FIT-3配基、TPO, IL-6、7、8、11、12、14、15和LIF等。这些细胞因子在造血干细胞的增殖和分化中发挥重要作用。目前主要是根据其形态、抗原表型及分化潜能来鉴定MSCs。MSCs高表达MHC I类分子、SH2, SH3, CD29, CD44, CD73, CD90, CD106, CD120a, CD124,低表达MHCⅡ类分子及Fas配体,不表达造血细胞表面标志CD34, CD45, CD14, CD117和与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR, B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD40及Fas凋亡受体等,这表明MSCs在免疫调节中具有重要作用,预示着植入MSCs后不会引起或引起极低的免疫排斥反应。本课题的第一部分是利用密度梯度离心和贴壁培养法相结合提取、纯化4周龄Wistar大鼠的骨髓间充质干细胞并培养传代,得到数量、活性、纯度高而较均一的骨髓间充质干细胞,应用流式细胞术鉴定其纯度,为下一步联合培养打下基础。MSCs能够诱导免疫耐受。有研究表明骨髓间充质干细胞具有组织同源性,联合胰岛移植时,其可以抑制T细胞激活,从而使受体与移植胰岛形成微嵌合状态,使移植术后不用长期服用抗排斥药物,达到移植胰岛的长期存活。胰岛的死亡,包括分离和培养过程中β-细胞的丢失,仍然是成功胰岛移植中的重大障碍。胰岛细胞死亡(包括细胞凋亡和β-细胞失活)的主要原因是因为胰岛分离纯化及培养过程中移植胰岛缺氧及营养缺失。因此为了阻止胰岛的死亡和加强移植胰岛的功能,出现了许多改善细胞培养条件的手段。近年来的研究表明间充质干细胞可通过分泌营养因子、抗炎性因子、抗凋亡因子或者通过细胞-细胞接触、融合等方式参与组织器官的损伤修复,维持正常组织细胞功能。目前对于MSCs对移植胰岛的潜在营养作用目前尚未完全清楚,尽管已有研究证实由MSCs分泌的因子如白介素-6(IL-6),血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),可以提高移植后移植胰岛的质量。但是,对间充质干细胞作为滋养细胞来产生营养作用及相关分子信号级联传导的机制仍然知之甚少。本实验第二部分利用间充质干细胞与移植胰岛联合培养,观察其在延长胰岛体外存活时间、保护胰岛功能等方面的作用。为胰岛移植前如何有效的保存移植胰岛的功能做一定的探索。第一部分间充质干细胞的提取、纯化、传代培养及鉴定目的建立Wistar大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法,为进一步的研究打基础。方法利用密度梯度离心和贴壁培养法相结合提取、纯化4周龄Wistar大鼠的骨髓间充质干细胞并培养传代扩增,得到数量、活性、纯度高而较均一的骨髓间充质干细胞,应用流式细胞术鉴定其纯度。使用trypan blue染色鉴定其活性。结果骨髓间充质干细胞培养传代3代后流式细胞术检测CD45阴性率为94%,CD90阳性率为95%,两者荧光强度有显著性差异,活性均大于95%,纯度及活性均达到了进一步临床实验的要求。结论及意义利用密度梯度离心和贴壁培养法相结合来分离、培养、纯化及扩增骨髓间充质干细胞,可以获得高活性高纯度的MSCs,是实用、便捷和可行的方法。同时对成功培养过程中注意事项加以总结,为下一步联合移植胰岛培养提供种子细胞打下了基础。第二部分联合间充质干细胞培养对大鼠移植胰岛的保护作用的研究目的有研究证明骨髓间充质干细胞除了可在特定条件下跨胚层分化为多种组织细胞外,还可通过分泌细胞因子或者通过细胞-细胞接触、融合等方式参与组织器官的损伤修复,维持正常组织细胞功能。本研究探讨间充质干细胞与移植胰岛联合培养在延长胰岛体外存活时间、保护胰岛功能等方面的作用。方法使用Histopaque-1077一步法,建立密度梯度来分离纯化Wistar大鼠胰岛,并对提取胰岛的数量和活性进行评估；25只Wistar大鼠每只老鼠提取直径在50μm以上的胰岛按随机对照表法将胰岛培养分单纯胰岛基础培养、单纯胰岛高糖培养、胰岛与间充质干细胞联合基础培养、胰岛与间充质干细胞联合高糖培养四组,每组又分3小组(3d组、7d组、14d组),15孔／组；观察胰岛形态变化及胰岛存活率,酶联免疫吸附法(ELISA)检测胰岛素分泌量及刺激指数。结果联合培养组3d、7d、14d的胰岛存活率均显著高于单纯培养组,P<0.01；高糖刺激下联合培养组7d的胰岛素分泌量及刺激指数均高于单纯培养组,P<0.01。结论间充质干细胞与胰岛联合培养可以明显延长胰岛体外存活时间并保持其活性,对胰岛具有良好的保护作用。意义证明了通过间充质干细胞与移植胰岛联合培养可明显延长移植胰岛体外存活时间并保护其活性,为临床胰岛移植中移植胰岛功能的保护及数量的节省提供了新的思路与路径。