牛支原体(Mycoplasma bovis,M bovis)是牛肺炎的主要致病菌之一,此外,该菌还可引发乳腺炎、关节炎以及脑膜炎等多种疾病,严重威胁畜牧业生产。在如何控制上述疾病的传播和降低其造成经济损失的过程中,M bovis的快速、准确检测至关重要。本研究运用16S rRNA扩增子测序及宏基因组测序明确患呼吸道疾病牛的鼻腔微生物的组成和丰度,确定M.bovis的感染情况,并利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymerase amplification,RPA)建立M.bovis的检测方法,对患病牛早检测、早发现、早隔离、早治疗及牛呼吸道等疾病的防控具有积极意义,可为畜牧业健康发展提供技术支持。本研究通过对宁夏地区临床样本进行16S rRNA扩增子测序及宏基因组测序分析,明确了 M.bovis是牛呼吸道疾病中的关键致病菌;建立了 M.bovis的Basic RPA、nfo RPA、exo RPA三种检测方法,并对临床样本进行了初步检测,获得了如下实验结果:(1)盲采宁夏地区5个规模化养殖场患有呼吸道疾病的牛鼻拭子(18个),并以健康牛鼻拭子(1 1个)为对照组,通过16S rRNA多样性分析发现,患病组与健康组在牛鼻腔微生物的组成方面具有显著性差异,患病组区别于健康组的主要病原微生物为支原体属。(2)将上述样本进行宏基因组测序,通过KRONA分析,明确了造成患病组与健康组主要差异的病原微生物为M bovis。(3)生物信息学分析结合PCR技术,初步筛选了 LppA等8个用于检测M.bovis的特异性标识基因。(4)建立了基于LppA基因的M bovis Basic RPA检测方法,在39℃条件下,反应20 min,即可利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有良好的特异性,与引起牛肺炎的其他相关致病菌无交叉反应,敏感性试验最低检测限度为6×101copies/μL,且具有良好的批内、批间重复性。(5)建立了基于LppA基因的M bovis nfo RPA检测方法,在39℃条件下,反应10 min,即可通过侧流层析试纸条进行检测,具有良好的特异性,敏感性试验最低检测限度为3×101 copies/μL,批内、批间重复性良好。(6)建立了基于LppA基因的M.bovis exo RPA检测方法,在39℃条件下,反应15 min,即可通过T16-ISO恒温荧光扩增仪检测,特异性良好,敏感性试验最低检测限度为6×102 copies/μL,具有良好的批内、批间重复性。(7)采集宁夏地区牛鼻拭子临床样本118份,使用本研究建立的三种M bovis检测方法对临床样本进行检测,并将检测结果与PCR检测结果相比较。分析发现,PCR检测的阳性率为 28%;M bovis Basic RPA、M bovis nfo RPA、M bovis exo RPA 检测的阳性率分别为29%、35%、33%,灵敏度均高于PCR。综上所述,本研究明确了患有呼吸道疾病的牛鼻腔微生物与健康牛鼻腔微生物的物种组成具有显著性差异,且M.bovis是造成患病组与健康组差异的主要微生物;建立了 Basic RPA、nfo RPA、exo RPA三种M.bovis检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好,快速、简便、无需大型仪器设备,可为M.bovis的检测以及牛支原体病的防控提供技术支持。