乳酸菌作为一类与人类生产生活密切相关的有益菌,现在正得到越来越广泛的应用。它能合成并分泌产生胞外多糖,该胞外多糖具有增加发酵乳制品粘稠度、改善乳制品的口感和风味及提高乳制品的营养价值等功能。乳酸菌由来胞外多糖还具有黏附作用,改善肠道微生物的菌群结构,促进肠道健康,此外还具有抗氧化、免疫调节作及抗肿瘤等一系列生理保健作用。本研究通过从云南特有的豆豉、牦牛奶、酸泡菜等传统发酵食品中分离纯化得到42株菌株乳酸菌,经过革兰氏染色,同时基于16S rRNA和dna K基因进行菌种鉴定,并构建系统进化树。经对其16S rRNA分析表明,42株菌株中有36株属于植物乳杆菌,4株属于戊糖乳杆菌,1株属于戊糖片球菌,1株属于干酪乳杆菌;而基于dnaK鉴定则发现,26株属于植物乳杆菌,9株属于植物乳杆菌植物亚种,4株属于戊糖乳杆菌,1株属于副干酪乳杆菌,1株属于副植物乳杆菌,基于16S rRNA鉴定和dna K菌种鉴定结果略有不同。本研究选取了 YM-2菌株和SP8菌株作为研究对象,是综合考虑这两株菌株的EPS合成量、相关基因组成及其胞外多糖的抗氧化特性的差异性而选取。对38株乳酸菌菌株生物合成的胞外多糖的产量进行研究发现,其产量大约为14 mg/L至135 mg/L。其中SP8菌株的EPS产量最低,为14.779 mg/L;而JHM6-30菌株的EPS产量最高,为133.864 mg/L;此外YM-2菌株EPS的产量为25.45 mg/L。大部分菌株的EPS产量为80 mg/L-130 mg/L,只有4株菌株的EPS产量在70 mg/L以下,高于130 mg/L的只有1株。在后续试验中发现,这些菌株的EPS产量并不稳定,最后各菌株的EPS产量均在200 mg/L左右,这可能与各菌株的代谢活性有关。运用响应面分析优化植物乳杆菌YM-2菌株和SP8菌株生物合成胞外多糖的条件,发现在碳源,氮源,培养温度和时间四个培养条件中,两株植物乳杆菌的胞外多糖的合成量随着氮源含量的增加而增加;而葡萄糖浓度的变化对胞外多糖的合成量并无明显影响,葡萄糖浓度增大时,胞外多糖合成量增加不大,当葡萄糖浓度过大时,胞外多糖的合成量反而有所下降,葡萄糖对胞外多糖的合成产生反向抑制作用;培养时间和温度对YM-2菌株和SP8菌株的胞外多糖合成量的影响显著。起始培养时,胞外多糖的合成量随着培养时间的增加而提高,当培养到一定阶段时,胞外多糖的合成量随着时间的增加而下降。这是因为菌体在培养起始阶段以胞外多糖的合成为主,当培养到一定阶段时,菌体的营养环境条件恶化,菌体以分解多糖获取能源为主;当起始培养温度较低时,胞外多糖的合成量随着温度的升高而提高,当达到一定温度时,胞外多糖的合成量随着温度的升高而下降,这是因为温度过低和过高都会抑制与多糖合成相关的生物酶的活性,从而使得胞外多糖的合成量下降。通过响应面优化的方法得到胞外多糖合成的最优条件分别为:YM-2菌株为碳源30 g/L,氮源30 g/L,培养时间为30.05小时,培养温度为36.36℃,理论胞外多糖合成量为255.254 mg/L;而SP8菌株最优发酵条件是碳源21.97 g/L,氮源30 g/L,培养时间为22.17小时,培养温度为35.61℃,理论胞外多糖合成量为282.494 mg/L。这与验证试验分别获得的实际合成量257.362 mg/L和280.105 mg/L相近,因此通过响应面试验设计获得的模型具有可信性。本研究还对6株植物乳杆菌所合成的胞外多糖的抗氧化活性进行分析。样品和维生素C的浓度梯度分别设定为50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL和200 μg/mL,胞外多糖抗氧化活性的测定以维生素C作为阳性对照。发现各菌株的胞外多糖的抗氧化活性与维生素C相比相对较弱,但均具有一定的抗氧化活性,并且抗氧化活性与浓度呈正相关关系。当EPS的浓度为50μg/mL时,6种EPS对DPPH自由基的清除能力没有显著性差异,而当EPS的浓度为100μg/mL、150μg/mL及2000μg/mL时,6种EPS对DPPH自由基的清除能力具有极其显著的差异性。其中YM-2菌株生物合成的EPS的抗氧化活性最好,在各EPS浓度下对DPPH自由基的清除活性明显高于其他的胞外多糖,其余依次为是KY1-2L菌株、SP8菌株、QB3-4菌株、HH4-7L菌株和JHM6-30菌株生物合成的胞外多糖,并且JHM6-30菌株在EPS高浓度时对DPPH的清除能力增强。利用薄层层析技术和气相色谱技术分别定性测定了两株菌所产胞外多糖的单糖种类。在薄层层析分析中,发现YM-2菌株的胞外多糖的组分主要为乳糖和蔗糖,还含有少量半乳糖;而SP8菌株的胞外多糖的组分主要为乳糖和半乳糖,分析发现这两种胞外多糖的单糖组分分别为葡萄糖、半乳糖以及果糖。在气相色谱分析中发现YM-2菌株和SP8菌株生物合成的胞外多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、N-乙酰氨基葡萄糖以及半乳糖,不含有葡萄糖组分,这与已研究报道的乳酸菌杂多糖组分差别较大。近年来,越来越多的EPS合成相关基因簇被克隆。Lactococcus lactis NIZOB40菌株的EPS由eps RXABC DEFGIJKL 14个基因作用产生,各基因均有其明确的生理功能。而Lb.rhamnosus ATCC9595的胞外多糖合成基因簇长度约为18.7Kb,含有18个相关基因。其中wzd和wze基因负责确定多糖链的长度,wel F、wel G、wel H、wel I、wel J、wel E共同负责编码糖基转移酶,wzm可能编码异戊烯基转移酶,wzx可能编码运输糖的重复单元的蛋白,rml A、rml B、rml C、rml D负责编码鼠李糖前体。作为植物乳杆菌标准株的WCFS1菌株全基因组中共有四个EPS合成基因簇,分别为cpsl(ABCDEFGHI)基因簇、cps2(ABCDEFGHIJK)基因簇、cps3(ABDEHIJ)基因簇和cps4(ABDHIJ)基因簇。本研究将植物乳杆菌WCFS1作为植物乳杆菌标准菌株,标准菌株包含有cps2,cps3,cps4,glf2 等与植物乳杆菌胞外多糖生物合成相关的基因簇及基因。通过PCR扩增和测序,发现了 39株菌中与胞外多糖合成相关的基因及其差异性和共性。其中28菌株与33菌株的基因组成完全相同;SP8菌株与SP8-7L菌株的基因组成相同,但只有cps2(C)基因,其他基因全部缺失;9菌株、HH4-1L菌株、HH4-2L菌株的基因组成相同;HH4-7L菌株、7菌株、22菌株、24菌株、27菌株、30菌株、31菌株等7株菌的基因相同。大多数菌株缺失cps2基因簇,但保留有cps2(D)基因。在YM4-3菌株、KY1-2L菌株、28菌株、33菌株、32菌株、YM4-5菌株中保留有部分cps2基因簇组分,而S11菌株中只存在cps2(AB)基因;cps3基因簇都出现不同程度的缺失,而QB3-3菌株、QBLB3-1菌株和QB3-2菌株中的cps3基因簇全部缺失;绝大部分菌株的cps4基因簇相对完整,部分植物乳杆菌如23菌株和KY6-2L菌株,只有cps4基因簇存在。此外各菌株中一般都含有glf2基因。