论文部分内容阅读
旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种在同一宿主体内完成复杂生命周期的人兽共患食源性寄生性线虫,其通过包含有感染性肌幼虫的肉类感染动物和人类。为防控旋毛虫通过食物链传播给人类,迫切需要敏感性高特异性好的多宿主通用型血清学诊断技术,用以监测动物和人类宿主在旋毛虫中的暴露风险。本研究以感染后6 h的肠道感染性幼虫c DNA文库中筛选获得的高丰度强抗原性基因CLP为研究对象,采用大肠杆菌原核表达系统和Ni-NTA亲和层析,结合一步柱上复性纯化策略获得可溶性重组蛋白r CLP,建立基于r CLP抗原的间接ELISA（r CLP-i ELISA）方法。采用270头份健康猪血清、1000和50000条肌幼虫/头人工感染猪血清系统地评价了r CLP作为检测靶标的适用性,与基于肌幼虫ES产物的间接ELISA（ES-i ELISA）商品化试剂盒相比具有更早的血清抗体阳性转化时间。常规方法免疫小鼠制备单克隆抗体（Mc Ab）,分别采用r CLP-i ELISA、ES-i ELISA和阻断ELISA方法筛选获得3株能够与猪阳性感染血清竞争结合r CLP抗原的高亲和性Mc Abs 1H9、6B5和7F8。Mc Abs 1H9和6B5所识别的优势B细胞线性表位为39 HEALFSSDLKQESGV 53,Mc Ab 7F8所识别的优势B细胞线性表位为178 REALFSSDSKEQSGV 192。然后,以Mc Ab 1H9和r CLP抗原为基础建立竞争ELISA（r CLP-c ELISA）方法用以检测多种宿主血清中旋毛虫特异性抗体。采用猪（n=1316）、小鼠（n=189）和人（n=169）宿主血清样本对r CLP-c ELISA方法的敏感性和特异性进行了系统地评价。结果显示,r CLP-c ELISA方法在田间猪血清样本中敏感性为100%,特异性为99.56%,在区分健康志愿者和旋毛虫病人血清的检测中,其敏感性为97.01%,特异性为94.12%。r CLP-c ELISA方法与其他寄生虫感染猪/患者血清以及其他病毒疫苗免疫猪/肠道病毒感染患者血清均无交叉反应,优于ES-i ELISA试剂盒。同时具有应用于T.spiralis,T.nelsoni和Trichinella T8感染小鼠的血清学诊断中的潜力。为进一步提高诊断方法的敏感性,将兔抗CLP多克隆抗体修饰在磁性纳米颗粒表面,构建磁珠探针（MNP-Pc Ab probe）作为捕获探针。将寡核苷酸单链（触发链I1）修饰在金纳米颗粒表面,同时将Mc Ab 1H9与金纳米颗粒进行偶联,构建双功能化金纳米颗粒探针（Au@Mc Ab-I1 probe）作为竞争探针。采用竞争-三明治术式建立了基于双功能化金纳米颗粒探针和杂交链式反应的旋毛虫抗体检测方法（Au@Mc Ab-I1-i HCR）。该方法对169份健康志愿者/临床患者血清具有较高的诊断准确性（AUC=0.9985）,其敏感性为97.01%,特异性为99.02%,且在其他寄生虫/肠道病毒感染患者血清中无交叉反应。Au@Mc Ab-I1-i HCR和r CLP-c ELISA方法对旋毛虫病患者血清的测定值之间存在极强相关性（R2=0.9149）。相比于ES-i ELISA试剂盒,Au@Mc Ab-I1-i HCR方法在相近的检测时间内具有更低的最低检出限（24.20 ng/m L）,敏感性更高。对不同剂量人工感染猪血清中CLP抗体消长规律进行测定,其呈现出“抗体滴度上升——转而略微下降——而后持续上升”的趋势。为分析CLP介导下特殊的抗体应答现象,以BMDCs、OT-Ⅱ小鼠CD4+T细胞及B细胞为研究对象,利用体外共孵育的方式进行CLP免疫调节活性和其对抗体生成影响的研究。结果显示,CLP抑制BMDCs介导下由na?ve CD4+T细胞激活所指导的B细胞活化及抗体生成过程,该调控效应为所建立的血清学抗体诊断方法测定的CLP抗体消长规律提供了部分理论支持。