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目的：本实验以调肝肾、祛痰瘀复方为干预因素,以SHR大鼠血压峰值前两小时为复方给药时间(即：19：00和00：00),综合采用多种检测方法(逆转录聚合酶链式反应、蛋白印迹、酶联免疫吸附测定法、电镜光镜及免疫组化等),深入探讨观察调肝肾、祛痰瘀复方对自发性高血压大鼠(SHR)的血压、肾功能、肾组织形态学和肾Ⅰ、Ⅳ型胶原含量、肾Ang ‖含量、肾TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、CTGF、ECM的桥连接蛋白(FN)基因表达以及TGF-β1、CTGF、FN1蛋白表达影响。从整体水平、组织形态学、基因及蛋白等各方面,观察调肝肾、祛痰瘀复方血压峰值前给药对SHR的降血压及肾脏保护的作用,探讨其作用机制,从时间生物学上为高血压病的临床治疗而提供实验的依据,并为中医药对高血压病的治疗和肾脏保护作用的研究和开发提供思路和理论依据。内容与方法：研究内容：1.中药复方峰值前给药对SHR早期肾损害的影响；2.中药复方峰值前给药对SHR心肾组织形态学的影响；3.中药复方峰值前给药对SHR的TGF-β1-CTGF-FN1信号通路调节影响；4.中药复方峰值前给药对SHR的TGF-β1-Smads信号通路调节的影响。实验方法：1.中药：调肝肾、祛痰瘀复方(成人一日量)熟地25g、龟板30g(先煎)、丹参15g、瓜萎12g、田七5g、钩藤12g(后下)以上药材均购自广州市药材公司中药饮片厂生产,编号：13093120等,并经过鉴定符合药典标准。常规煎药(浓度含生药200mmg·mL-1)。药液冷却后,置于4℃冰箱内保存备用。氯沙坦商品名：科亚素,批号：130101,100mg/片,由杭州默沙东制药有限公司生产。2.实验动物及分组实验采用11周龄SPF级自发性高血压大鼠(即SHR)模型30只及SD大鼠10只,体重220±20g。分别购于北京维通利华生物科技有限公司以及广州中医药大学实验动物中心。大鼠于实验前常规观察1周,然后进行分组实验。SHR大鼠30只随机分为3组：中药复方组、模型组、西药组(氯沙坦组),每组各10只；SD大鼠10只作为正常对照组。全程给予高蛋白固体颗粒饲料喂养。3.给药及喂养方式：中药复方组每天按照最佳给药时间(即：19：00和00：00)灌胃两次,按照临床等效剂量,为4g·kg-1；西药组按照常规给药早上灌胃一次,剂量为0.03g·kg-,模型组和对照组给予0.144 g·kg-1的生理盐水,共12周。4.收缩压测量：于给药前和给药后2、4、6、8、10、12周用无创血压测定仪测定血压,记录各组大鼠收缩压。5.Elisa法检测大鼠尿微量白蛋白(mALb)、尿β 2微球蛋白(β 2-MG)水平。6.全自动生物化学分析仪检测每组大鼠血清的肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量。7.电镜和光镜观察每组大鼠肾脏形态学的变化。8.免疫组化法检测肾组织的Ang Ⅱ、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ、Smad2,Smad3和Smad7原积分光密度值的变化。9.RT-PCR法检测肾组织中TGF β1,CTGF,FN,Smad2,Smad3和Smad7的mRNA表达。10.Western blot法检测肾组织中TGF-β 1,CTGF和FN蛋白的表达。结果：1.用药前后血压的变化实验用药前与用药后2周、4周、6周、8周、10周和12周分别采用智能无创血压计,监测每组大鼠尾动脉的收缩压变化。结果显示,用药前SHR各组大鼠的血压均高于SD组,SD组与其他各组比较,有显著统计学意义(P<0.01),而其余各组间比较,无统计学意义(P>0.05)；给药2周后：显示西药组的收缩压明显降低,与模型组比较有统计学意义(P<0.01),而中药复方组的大鼠收缩压也有一定程度的下降,但与模型组相比无统计学意义(P>0.05)；给药4周后：西药组的收缩压持续下降,西药组与SHR组相比具有显著统计学差异(P<0.01),中药复方组开始显示降血压的效果,与SHR组比较有统计学意义(P<O.01),与西药组比较有统计学意义(P<0.01)；给药后6周-10周：西药组和中药复方组持续降压,中药组与模型组相比具有显著统计学差异(P<0.01),与西药组比较有统计学意义(P<0.01),西药组和模型组相比有明显统计学意义(P<0.01)；给药后12周：中药复方组和西药组一直平稳降压,中药复方组效果逐渐接近西药组,与西药组没有统计学意义(P>0.05)。2.各组大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量与正常组比较,模型组肌酐(SCr)含量明显上升(P<0.01)；与模型组比较,复方组肌酐(SCr)含量明显下降(P<0.01)。与正常组比较,模型组、复方组和西药组的尿素氮(BUN)含量明显上升(P<0.01),模型组、复方组和西药组并无统计学差异(P>0.05)。3.各组大鼠尿微量白蛋白(mALb)、尿β2微球蛋白(β2-MG)的含量与正常组比较,模型组mALb蛋白表达明显上调(P<0.01)；与模型组比较,复方组mALb蛋白表达明显下调(P<0.05),而西药组没有明显调节作用。与正常组比较,模型组和西药组β2-MG蛋白表达无明显变化,复方组β 2-MG蛋白明显下调(P<0.05)。4.肾脏组织光镜下形态学比较复方组：大鼠肾小球的系膜细胞和系膜基质均未见明显增生,肾小管的上皮细胞完好,间质未见沉着的纤维结缔组织和炎细胞浸润,管腔内未见管形；西药组：肾小球有轻度增生的系膜细胞和系膜,管腔内未见管形,肾小管上皮细胞完好；正常对照组：大鼠肾小球的系膜细胞未见明显的增生,管腔内未见管形,肾小管上皮细胞完好,系膜基质未明显增多,间质未见沉着的纤维结缔组织和炎细胞浸润；模型组：大鼠肾小球明显萎缩,坏死,管腔轻微变窄。5.肾脏组织电镜下形态学比较复方组：肾小球系膜细胞核系膜基质未见明显增生,上皮细胞足突排列整齐；西药组：肾小球系膜细胞伸出的足突相互融合,形成片状,轻度增粗,相邻的基膜增厚；模型组：肾小球系膜细胞核大,胞浆少,周围基膜明显增厚,胶原纤维增生明显；正常对照组：肾小球系膜细胞、基质未见增生,基膜厚度均匀,上皮细胞足突排列整齐。6.免疫组织化学方法检测各组大鼠Collagen Ⅰ型和Ⅳ型蛋白表达的分析结果与正常对照组比较,模型组Collagen Ⅰ型和Ⅳ型的蛋白表达均明显上调(P<0.01)；与模型组比较,复方组和西药组Collagen Ⅰ型和Ⅳ型的蛋白表达均明显下调(P<0.01),复方组和西药组Collagen Ⅰ型和Ⅳ型蛋白表达无统计学差异(P>0.05),复方组Collagen Ⅰ型和空白组没有统计学差异(P>0.05)。7.免疫组织化学方法检测各组大鼠肾组织Ang ‖蛋白表达的分析结果与正常对照组相比,模型组的肾脏组织Ang ‖蛋白的表达均明显上调(P<0.01)；与模型组比较,复方组和西药组肾组织Ang ‖的蛋白表达均明显下调 (P<0.01),两组间肾组织的Ang ‖蛋白表达无统计学差异(P>0.05)；其中,复方组和西药组的肾组织Ang ‖蛋白表达与空白组没有统计学差异(P>0.05)。8.免疫组织化学方法检测各组大鼠肾组织Smad2,Smad3和Smad7蛋白表达的分析结果与正常对照组比较,模型组Smad2和Smad3的蛋白表达均明显上调(P<0.01),Smad7的蛋白表达相应下调(P<0.01)；与模型组比较,复方组和西药组Smad2和Smad3的蛋白表达均明显下调(P<0.01),Smad7表达均明显上调(P<0.01),复方组和西药组的Smad2.Smad3和Smad7蛋白表达无统计学差异(P>O.05),其中,复方组的Smad7蛋白表达与正常对照组没有统计学意义(P>0.05)。9.肾脏组织中Smad2,Smad3和Smad7的mRNA水平表达与正常对照组比较,模型组Smad2和Smad3的mRNA表达均明显上调(P<0.01),Smad7的mRNA表达相应下调(P<0.01)；与模型组比较,复方组和西药组Smad2和Smad3 mRNA的表达均明显下调(P<0.01),Smad7 mRNA的表达均明显上调(P<0.05),复方组和西药组Smad2.Smad3和Smad7 mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。10.肾脏组织中TGF-β1,CTGF和FN的mRNA水平的表达与正常对照组比较,模型组TGF-β1,CTGF和FN的mRNA表达均明显上调(P<0.01)；与模型组比较,复方组TGF-β1的mRNA的表达均明显下调(P<0.01),且优于西药组(P<0.05)；复方组CTGF和FN的mRNA的表达均明显下调(P<0.01),和西药组没有统计学差异(P>0.05)。11.肾组织中TGF-β1、CTGF、FN的w estern blot蛋白水平表达与正常组比较,模型组CTGF、FN蛋白表达均明显上调(P<0.01)。与模型组比较,复方组TGF-β1、CTGF、FN蛋白表达均明显下调(P<0.01)；西药组TGF-β 1、FN蛋白表达均明显下调(P<0.01或0.05)。与西药组比较,复方组CTGF和FN的蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论：1.调肝肾、祛痰瘀复方血压峰值前给药可以降低SHR的血压。2.调肝肾、祛痰瘀复方血压峰值前给药可以降低SHR血清肌酐(SCr)的含量,降低尿微量白蛋白(mALb)、尿β2微球蛋白(β 2-MG)的含量,改善肾损害的病理状态,具有肾保护作用。3.调肝肾、祛痰瘀复方对肾脏的保护作用机制,可能是通过降低Ang ‖蛋白水平,上调Smad7,下调Smad2和Smad3的mRNA表达,从而降低肾组织中的中Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白含量,减少异常聚集的ECM,增加ECM的降解,延缓肾小管和间质的纤维化。4.调肝肾、祛痰瘀复方肾保护的作用靶点,可能是通过调节TGF-β1-Smad s和TGF-β1-CTGF-FN的传导通路,抑制病理条件下肾小管的上皮细胞向间充质细胞的转分化(EMT),减少胶原的产生,促进ECM降解,延缓肾功能损伤的。创新性：1.将峰值前给药以及靶器官的保护与中医“调肝肾、祛痰瘀”复方以及天人相应、阴阳升降理论结合起来,既有中医特色,又可丰富和创新中医时间医学的科学内涵,延伸之前的实验内涵。2.首次以“调肝肾,祛痰瘀”为法,从肾损害的传导通路入手,从调控机体昼夜节律角度,探讨防治高血压及对肾脏保护效应及机制。