妊娠初期,滋养细胞具有独特的类似肿瘤细胞的生物学行为,即高增殖、低凋亡和高迁移及侵袭力；同时滋养细胞的生物学行为受到蜕膜微环境的严格调控,这对囊胚植入、胚胎发育和正常妊娠的维持起关键作用。近年来研究发现,氧化应激参与多种病理性妊娠的发病,与流产、先兆子痫、胎儿生长受限(FGR)、早产及死胎等妊娠并发症密切关联。过量的活性氧自由基(ROS)可使磷脂中的不饱和脂肪酸生成过氧化脂质,损伤生物膜；可以抑制蛋白质功能,破坏核酸及染色质,从而伤害机体的各种组织和细胞,包括导致滋养细胞凋亡,降低细胞侵袭力。因此,控制氧化损伤对于成功妊娠和正常妊娠的维持具有重要意义。环孢素A(CsA)是具有划时代意义的免疫抑制剂,其临床应用可显著改善实体器官移植的近期存活率,是器官移植后免疫抑制和抗排斥反应的首选药物。我们课题组首次发现,低浓度CsA可显著提高滋养细胞的增殖与侵袭力,抑制低血清培养诱导的滋养细胞凋亡,并改善小鼠流产模型的妊娠结局,提示CsA可能为滋养细胞功能障碍导致的妊娠疾病的潜在治疗药物。与CsA经典的细胞内信号转导通路不同,我们课题组的研究结果显示,CsA可通过活化MAPK/ERK通路提高滋养细胞的增殖及侵袭力。本研究在前期工作基础上,进一步研究在细胞生物学功能调控中起重要作用的粘着斑激酶(FAK)信号通路是否参与CsA调节滋养细胞的迁移与侵袭；并通过用H202处理人绒毛膜上皮癌细胞系JEG-3细胞,建立滋养细胞氧化损伤的体外模型,在氧化应激条件下进一步解析CsA减轻滋养细胞损伤的分子机制,以及相应的细胞内信号转导通路,为拓展CsA的临床应用提供科学依据。第一部分环孢素A通过FAK信号通路促进滋养细胞迁移与侵袭目的探讨FAK信号通路是否参与介导CsA促进滋养细胞迁移与侵袭,以及FAK信号通路与ERK信号通路间的相互作用。方法用CsA(1gM)处理滋养细胞,或用FAK抑制剂Y15、Src抑制剂PP2、MEK抑制剂U0126分别预处理滋养细胞后再用CsA处理,采用Transwell迁移试验和Matrigel侵袭试验分析滋养细胞的迁移及侵袭力,Western blot分析滋养细胞FAK、Src及ERK的磷酸化水平及E-钙粘蛋白(E-cadherin)和金属基质蛋白酶MMP2、MMP9的表达水平,明胶酶谱实验分析滋养细胞培养上清MMP2、MMP9的活性。结果CsA可显著提高原代滋养细胞及JEG-3细胞FAK及其接头分子Src的磷酸化水平。Y15和PP2均能阻断CsA升调节滋养细胞的迁移及侵袭。Y15和PP2可抑制CsA增高的FAK、Src及ERK的磷酸化水平,U0126可抑制CsA增高的ERK磷酸化水平,但对FAK及Src的磷酸化水平无显著影响。Y15、PP2和U0126均可消除CsA对E-cadherin表达的下调作用和对MMP2、MMP9表达及活性的上调作用。结论CsA通过FAK-Src信号通路促进ERK信号通路活化,下调E-cadherin表达,上调MMP2、MMP9的表达及分泌,进而促进滋养细胞的迁移和侵袭。第二部分氧化应激损伤滋养细胞的生物学行为目的分析H202对JEG-3细胞生物学行为的影响,建立滋养细胞氧化应激损伤模型。方法用不同浓度的H202处理JEG-3细胞24h,采用MTT法分析滋养细胞活力,倒置相差显微镜及荧光显微镜观察细胞形态,DHE荧光探针检测细胞内ROS水平,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,Annexin V/PI双标记检测细胞早期凋亡,Matrigel侵袭试验检测细胞的侵袭力,以建立滋养细胞氧化损伤模型。结果500μM H2O2处理JEG-3细胞24h后,细胞活力显著下降,形态发生明显改变,细胞皱缩,间隙增大,体积减小,细胞核缩小,染色质凝集,呈颗粒团块状分布；细胞ROS产生增加,线粒体膜电位下降,凋亡比例升高,细胞侵袭力显著下降。更高浓度的H202(从7501μM开始)则诱发细胞大量脱落坏死,侵袭力丧失。结论JEG-3细胞经500gM H2O2处理24h呈现明显的氧化应激损伤,用此条件建立氧化应激模型,为研究滋养细胞氧化损伤及抗氧化应激药物的作用机制奠定了基础。第三部分环孢素A缓解氧化应激诱导的滋养细胞损伤目的解析CsA对H2O2诱导滋养细胞生物学行为损伤的保护作用及其分子机制。方法用低浓度CsA(1μM)预处理JEG-3细胞24h,再经H2O2(500μM)刺激诱导氧化损伤,采用MTT比色法分析滋养细胞活力,倒置相差显微镜及荧光显微镜观察细胞形态,Annexin V/PI双标记检测细胞早期凋亡,Matrigel侵袭试验检测细胞的侵袭力,DHE荧光探针检测细胞ROS水平,化学比色法检测细胞丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)的活性,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果与H202单独处理组比较,JEG-3细胞经低浓度CsA干预后,细胞活力明显升高,形态得以改善；细胞凋亡比例下降,侵袭力增加；细胞内ROS、MDA含量明显下降,SOD.CAT的活性显著升高；线粒体膜电位水平恢复；p53的表达和磷酸化水平下降,Bax表达减少,Bcl-2表达增加,caspase-3前体增多,裂解的PARP大片段减少。结论CsA干预可明显改善氧化应激状态下JEG-3细胞的生物学行为；减轻细胞氧化损伤程度,增强细胞的抗氧化损伤能力；抑制线粒体相关的凋亡信号通路及caspase-3活化,减少滋养细胞凋亡。第四部分环孢素A通过调节FAK-Src和MAPK信号通路缓解滋养细胞氧化损伤目的解析CsA缓解滋养细胞氧化损伤的信号转导通路。方法用低浓度CsA(1μM)处理JEG-3细胞24h,再经H2O2(500μM)刺激诱导氧化损伤,采用Western blot分析CsA对氧化应激的滋养细胞FAK.Src及MAPKs磷酸化水平的影响；在此基础上,用FAK抑制剂Y15、Src抑制剂PP2分别预处理处理JEG-3细胞,MTT法测定细胞活力,DHE荧光探针检测细胞内ROS水平,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,Annexin V/PI双标记检测细胞早期凋亡,Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭力；用MAPKs信号通路抑制剂(SB203580、SP600125、U0126)分别预处理JEG-3细胞,MTT法分析细胞活力。结果H202刺激可引起JEG-3细胞FAK、Src磷酸化水平下降,p38MAPK、JNK和ERK的磷酸化水平升高。CsA预处理JEG-3细胞后再经H202刺激,FAK、Src磷酸化水平明显升高,JNK磷酸化水平明显下降,ERK磷酸化水平无显著性变化。Y15和PP2处理细胞后,再经CsA和H202联合处理,与CsA和H202联合处理组比较,滋养细胞活力下降,ROS产生增加,线粒体膜电位下降,凋亡比例升高,侵袭力下降。p38MAPK抑制剂SB203580或JNK抑制剂SP600125处理细胞后,再经H202处理,滋养细胞活力较H202处理组升高；而MEK抑制剂U0126处理后,细胞活力进一步下降。结论低浓度CsA通过促进FAK-Src信号通路活化,抑制p38MAPK和JNK信号通路活化,发挥对氧化损伤的滋养细胞的保护作用。综上所述,本研究发现低浓度CsA对人滋养细胞的生物学行为具有多重调节作用：(1)通过FAK-Src信号通路促进ERK信号通路活化,下调E-cadherin表达,上调MMP2、MMP9的表达及分泌,促进正常滋养细胞的迁移和侵袭；(2)通过降调节ROS及MDA的生成,升调节SOD和CAT的活性,缓解滋养细胞氧化应激损伤；(3)通过抑制线粒体相关的凋亡通路,降低caspase-3活化水平,抑制氧化应激诱导的滋养细胞凋亡；(4)通过促进FAK-Src信号通路活化,抑制p38MAPK和JNK信号通路活化,发挥对氧化损伤的滋养细胞的保护作用。这些研究结果显示,CsA的药理作用及其细胞内信号转导通路远超过人们迄今为止的认识,有望成为一种新型保胎制剂,为临床防治妊娠失败、子痫前期、胎儿生长受限等病理妊娠提供了一种新的策略。