论文部分内容阅读
本论文由三部分工作组成:一、根据已发表的美洲拟鲽抗冻肽AFZP(Antifreeze peptide)基因序列设计了PCR引物,从含美洲拟鲽AFZP基因cDNA序列的细菌表达质粒中扩增出目的片段,将PCR扩增的目的片段克隆到pUC-19质粒并进行了序列测定,测序结果与已发表的美洲拟鲽AFZP基因cDNA序列完全一致,最后我们将AFZP基因cDNA序列从pUC-19质粒亚克隆到植物表达载体PBI-121的CaMV35S启动子及NOS终止子之间。采用花粉管通道方法,我们对数种植物进行了AFZP植物表达载体的转化,初步实验结果表明转化植株与野生植株相比显示了一定程度的耐寒能力。二、绿色木霉(Trichoderma viride)是一种有希望用于外源基因分泌表达的丝状真菌,为了探索在绿色木霉中进行分泌表达,我们将来源于巨大曲霉(Aspergillus giganteus)的抗真菌蛋白AFP基因(430 bp)开放阅读框(包含前导序列以及内含子)插入真菌表达载体TrpC基因的启动子和终止子之间,并利用表达载体中潮霉素抗性基因为筛选标记,以PEG介导的原生质体转化方法转化了绿色木霉,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,绿色木霉转化子分泌表达了具有抗真菌活性的成熟AFP,本部分的工作为研究在绿色木霉中分泌表达具有重要应用价值的异源真核蛋白打下了基础。三、丝状真菌内含子的剪接可能与其他高等真核生物相似,但它是否影响基因表<WP=3>达呢?对此,人们依然知道的很少。巨大曲霉(Aspergillus giganteus)的抗真菌蛋白AFP基因(430 bp)开放阅读框中间有两个小的内含子(89 bp和56 bp),具有保守的剪接位点及丝状真菌内含子的一些典型特征。为了解内含子是否会影响AFP基因的表达,我们构建了插入AFP基因(430 bp)或无内含子的AFP基因(即285 bp 的AFP cDNA序列)的真菌表达载体并将它们分别转化绿色木霉(Trichoderma viride),对转化子的表达分析结果表明,内含子的存在对于AFP基因的表达是必需的,这说明真菌内含子不仅仅只是被剪切的间插序列,它们还可能对基因表达产生关键影响。最近的研究表明AFP与寡核苷酸结合结构域有相似的结构特征,而已有研究通过比较ADH及其相关基因的内含子和外显子结构,证实,ADH基因的寡核苷酸结合结构域的进化是内含子依赖的,因此,基于以上这些事实以及我们当前的实验结果,有理由推测AFP基因的进化可能是内含子依赖的。此外,本室先前的一项工作认为在绿色木霉(Trichoderma viride)基因组中发现了一个沉默的无内含子的AFP基因,但是本文对绿色木霉原始菌株及转化株的PCR及Southern印迹分析均清楚的表明,绿色木霉(Trichoderma viride)基因组并不存在这一序列。