论文部分内容阅读
研究背景与目的:足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,其相邻足突间形成裂孔隔膜（Slit diaphragm,SD）,维持肾小球正常滤过功能。SD区结构和功能损伤将导致足细胞细胞骨架稳定性减弱、足细胞脱落/丢失,最终发生进行性蛋白尿。Nephrin是SD区的重要组成元件,跨膜表达于足细胞胞膜,其胞外段包含有Ⅲ型纤连蛋白样结构和IgG样区域,可通过嗜同性或嗜异性作用与相邻nephrin分子或nephrin同源分子结合,是SD区线性骨架结构的基础;胞内段含有多个酪氨酸残基能被邻近激酶活化,参与足细胞细胞骨架重构和细胞凋亡的调控。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要效应分子,可影响nephrin表达和磷酸化水平、诱导足细胞损伤,但具体机制不明确。c-Abl是一种非受体酪氨酸激酶,在终末分化细胞中表达丰富,可通过SH2、SH3结构域和多种配体蛋白结合,诱导其酪氨酸Y245和Y412位点磷酸化,从而激活c-Abl,具有活性的c-Abl介导下游多种信号通路,进一步参与细胞骨架重构、细胞凋亡、免疫及感染等生物功能的调节。研究发现,nephrin可募集Nck、Podocin、CD2AP等含有SH、SH3结构域分子,调节细胞骨架重构,但其与c-Abl的相互作用并不明确。本研究通过收集足细胞病患者肾活检标本,观察nephrin及c-Abl在足细胞病患者肾小球表达及共定位改变;通过构建Ang Ⅱ输注大鼠模型及体外培养足细胞,评价nephrin与c-Abl结合改变对足细胞细胞骨架重构的作用;通过转染nephrin特异性磷酸化重组质粒、c-Abl全长质粒及其关键结构域缺失突变质粒,评价nephrin与c-Abl相互作用位点,进一步探讨c-Abl在足细胞细胞骨架重构中的作用和机制。方法:第一部分:收集临床肾穿刺活检确诊为足细胞病（MCD、MN及FSGS）患者的肾组织标本,取肾肿瘤患者肿瘤旁正常组织标本为正常对照,免疫荧光双染评价足细胞病患者nephrin及c-Abl表达分布改变。将16只SPF级Wistar大鼠随机分为AngⅡ输注组和正常对照组。置入含有AngⅡ溶液或生理盐水的渗透性微量泵。AngII输注速度为400 ng·kg-1·min-1,正常组用等量生理盐水代替输注,持续输注14天。于造模后7天、14天收集大鼠24小时尿液以测量尿总蛋白定量,并于造模后14天处死大鼠、留取肾皮质组织标本,透射电镜观察大鼠肾小球足细胞超微结构,免疫荧光法检测大鼠肾小球nephrin与c-Ab1表达与分布。第二部分:体外培养条件永生化小鼠足细胞,构建myc-CD16/7-nephrin重组质粒稳定转染细胞系,CD 16抗体诱导nephrin特异性磷酸化,c-Ab1 siRNA干扰下调c-Ab1表达水平、或伊马替尼（STI571）抑制c-Ab1活性,随后将细胞分为正常对照组和AngⅡ刺激组（10-7MAngⅡ,24h）,蛋白印迹检测各组nephrin、c-Abl表达及活性,免疫荧光法检测各组nephrin与c-Abl分布改变,免疫共沉淀检测各组足细胞nephrin与c-Abl间相互作用,划痕实验检测各组足细胞迁移水平,FITC标记鬼笔环肽染色检测各组足细胞细胞骨架改变。第三部分:构建c-Abl全长质粒及SH2、SH3和FABD结构域缺失突变重组质粒,分别与myc-CD16/7-nephrin质粒共转染至COS7细胞,CD16抗体诱导nephrin特异性磷酸化,细胞松弛素D（CytD）诱导COS7细胞肌动蛋白骨架崩解,蛋白印迹检测COS7细胞内nephrin、c-Abl表达及活性,免疫荧光法检测COS7细胞nephrin与c-Abl表达分布,免疫共沉淀检测COS7细胞内nephrin与c-Abl间相互作用,FITC标记鬼笔环肽染色检测COS7细胞肌动蛋白骨架改变。结果:第一部分:（1）非足细胞病患者肾小球nephrin与c-Abl存在一定程度共定位分布,足细胞病患者肾小球nephrin与c-Abl共定位程度减低;（2）AngⅡ输注诱导大鼠尿蛋白明显增加,足细胞足突发生广泛性融合;（3）AngⅡ诱导大鼠肾小球nephrin与c-Ab1共定位程度减低。第二部分:（1）AngⅡ诱导体外培养小鼠足细胞nephrin和p-nephrin表达下调,nephrin与c-Ab1结合水平下降,c-Ab1分布出现核易位现象;（2）AngII刺激小鼠足细胞,导致细胞肌动蛋白骨架结构紊乱,足细胞迁移能力增加;（3）构建nephrin质粒稳定转染细胞系,并通过CD16抗体诱导nephrin特异性磷酸化后,nephrin与c-Ab1结合能力增强,同时AngⅡ诱导小鼠足细胞肌动蛋白骨架紊乱现象有所改善,细胞迁移能力下降。第三部分:（1）转染myc-CD16/7-nephrin重组质粒与c-Ab1全长重组质粒转染COS7细胞后,nephrin与c-Ab1无明显结合,且不能改善CytD诱导COS7细胞细胞骨架紊乱现象;（2）CD16抗体诱导nephrin特异性磷酸化后,nephrin与c-Ab1结合水平明显增强,COS7细胞骨架紊乱明显改善;（3）敲除c-Ab1蛋白SH2或SH3结构域,nephrin与c-Ab1结合水平下降,且不能改善COS7细胞骨架紊乱现象;（4）敲除c-Ab1蛋白FABD结构域不影响nephrin与c-Ab1结合水平,但不能改善COS7细胞骨架紊乱。结论:c-Ab1通过SH2、SH3结构域与磷酸化nephrin相结合,参与调控足细胞损伤导致的肌动蛋白细胞骨架重构。