研究背景与目的乳腺癌的发病率在发达国家女性恶性肿瘤中居于第一位。每年全球乳腺癌发病率的上升幅度达0.2-8%,约有140万新发患者。流行病学数据显示,我国女性的乳腺癌发病率和死亡率也在逐年增多,现已成为城市女性发病率最高的恶性肿瘤,并且年轻患者越来越多,而年龄是乳腺癌的预后因素之一,绝经期尤其是<35岁是预后不良的高危因素,基于种种因素,每年仍有约50万人死于乳腺癌。除此之外,影响乳腺癌生存率的因素还包括临床分期及其分子表型,其5年生存率约为83.3%,其中工期患者为97.1%,而Ⅳ期伴有远处转移者仅为24.5%,远处转移往往是乳腺癌的致死因素。在乳腺癌患者中,约有5%-20%为三阴性乳腺癌,这类患者其病情发展迅速,复发转移率高,生存率低,其5年生存率仅约15%。目前乳腺癌的治疗手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗及靶向治疗。手术是最根本的乳腺癌治疗手段,近年来手术方式进步迅速,但其进步更多的是着重于手术创伤的减低及美观,对术后复发、转移率没有较大改善。放疗对术后,尤其是保乳术后复发率的降低有所裨益,但对疾病的转移无效。化疗近年来获得长足进展,但副作用大,且易形成继发耐药,对晚期复发转移一般状况较差患者生存获益小,目前乳腺癌的发展已进入瓶颈阶段。内分泌治疗在乳腺癌是代表性治疗措施,已有研究标明,术后口服他莫昔芬5-10年可明显提高生存率,且内分泌治疗副作用小,耐受性好,可长期服用。但内分泌治疗仅对ER和／或PR阳性患者有效,对三阴性病人不适用。乳腺癌的靶向治疗在恶性肿瘤的靶向治疗领域出现较早,治疗规范,术后与化疗联用后单独应用曲妥珠单抗可明显提高Her-2阳性患者的生存率,对于复发转移的Her-2阳性患者,与化疗联用可提高化疗疗效,延长生存期,但曲妥珠单抗仅对Her-2阳性患者有效。而对于三阴性乳腺癌,目前尚无针对此类型患者的高效的特异性治疗,化疗方案亦沿用普通乳腺癌患者的化疗方案,无内分泌、曲妥珠单抗治疗的适应证,如前述,转移率高,5年生存率低。因此,急需寻找新的、更加有效、且毒性小的治疗手段来提高三阴性乳腺癌的治愈率。现在的观点认为,肿瘤的发生发展的一个重要的原因是已发生转化的细胞不能正常出现凋亡。现已知有多种因素参与诱导和抑制细胞凋亡过程,而细胞表面的受体和配体的相互作用在诱导细胞凋亡中起主导作用。TRAIL,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,成为目前研究的热点.TRAIL的5种特异性结合受体,即TRAIL R1、TRAIL R2、TRAIL R3、TRAIL R4和护骨素(OPG),决定了TRAIL的生物学作用,即在诱导细胞凋亡的过程中发挥着重要功能。TRAIL能选择性的诱导多种肿瘤细胞的凋亡,而对正常细胞几乎没有杀伤,其诱导凋亡作用不同于放化疗诱导细胞凋亡的机制,对化疗耐药的肿瘤也有一定的疗效,并可逆转化疗药物的耐药,因此具有广阔的临床应用前景。已有多项临床前及临床研究证实TRAIL是一种低毒高效的抗肿瘤靶向药物,并有研究证实TRAIL对三阴性乳腺癌也有很好的效果,尤其是对那些有间质表型的基底样细胞的作用更为突出。但最近的研究提示近半数的乳腺癌细胞系对TRAIL耐药,包括全部ER阳性细胞系及大部分Her-2阳性细胞系,而大部分三阴性乳腺癌细胞系对TRAIL敏感,但随着应用时间的延长,易出现继发性耐药,并且有数据表明,一旦肿瘤细胞出现耐药,则耐药肿瘤细胞的侵袭能力增强,临床会出现病情的迅速进展。而目前对TRAIL的耐药机制以及侵袭力增强的原因尚不明确。故探究TRAIL耐药机制可以为临床乳腺癌的治疗提供有意义的指导作用,并且对那些TRAIL耐药患者提供逆转耐药的可能途径。研究方法及结果为研究TRAIL的耐药机制,我们依据文献报道方法首先制备rhTRAIL,并经MTT分析证实其有效性。选择的细胞系为MDA-MB-231细胞,因为MDA-MB-231细胞为三阴性乳腺癌细胞,与我们的研究目的相一致,且MCF7等ER阳性乳腺癌细胞对TRAIL天然耐药,我们也应用MTT试验对MCF7进行了验证,得出了相同的结论。按照逐步增加rhTRAIL浓度的方法进行TRAIL耐药细胞系的构建,首先MTT法测定出MDA-MB-231细胞凋亡50%(IC50)时,rhTRAIL的浓度为12ng/ml,选择IC50时rhTRAIL浓度的1/8浓度,即1.5ng/ml为初始培养浓度,常规培养、传代细胞,逐步增加rhTRAIL的浓度,至最终浓度为4mg/ml,细胞存活良好。MTT法进行细胞存活率的检测,显示在rhTRAIL浓度达10ng/ml及以上时,rhTRAIL耐药的MDA-MB-231(231T)细胞与MDA-MB-231(231)细胞的存活率均有明显差别,p<0.01,差别具有显著统计学意义,耐药细胞的IC50较原细胞高10倍以上,证实rhTRAIL耐药细胞系构建成功。显微镜下观察231T细胞,发现耐药细胞系细胞聚集成麦穗样结构,与231细胞相比存在形态学上的差异。我们考虑其出现上皮细胞-间质转化(EMT),所以随后我们应用western blot方法分别检测了两种细胞中EMT相关蛋白的表达水平,包括N-cadherin,fibronectin及vimentin,结果发现,此三种蛋白在231T细胞中的表达明显高于231细胞,分别是2.79,2.16及2.13倍,p值均小于0.01。并且,在EMT过程中发挥核心作用的Snail蛋白,较MDA-MB-231细胞也上调了1.97倍,p<0.05,差别有统计学意义。由此,我们应用实时定量PCR (RT-PCR)检测了多个与EMT相关的转录因子的mRNA水平,包括Snai1、Twist1、Zeb2、Foxq1、FoxC2,结果发现只有Snail与Twistl在231T细胞中的表达上调,说明EMT的发生时通过Snail/Twist途径进行的。研究发现EMT的发生可使细胞的侵袭能力增强,故我们进行了Transwell实验检测TRAIL耐药对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响,结果显示,231T细胞的侵袭和迁移能力显著增强。为深入探讨TRAIL耐药及细胞发生EMT的机制,我们应用western blot法检测了耐药细胞中PTEN蛋白的表达水平,发现与231细胞相比,231T细胞的PTEN表达明显下调,为231细胞的69%,P值小于0.05。继而我们采用小干扰技术敲除231细胞中PTEN的表达,并western blot法检测siPTEN的干扰效率,构建了下调PTEN表达的MDA-MB-231细胞(231-siPTEN),其对照细胞为231-n。随后对231-siPTEN及231-n细胞进行了MTT、western blot及transwell检测。MTT结果显示,干扰PTEN表达后,231-siPTEN细胞对rhTRAIL耐药,与231-n细胞相比,在不同的rhTRAIL浓度,P值均小于0.05,证实PTEN参与MDA-MB-231细胞对TRAIL的耐药过程。Western blot结果显示,下调PTEN表达后,N-cadherin,fibronectin,vimentin,Snail均出现不同程度的上调,证实PTEN敲除后,诱导了EMT的发生,由此证实PTEN参与EMT发生的过程。Transwell试验进一步验证了干扰PTEN后,231-siPTEN细胞的迁移、侵袭能力均增强,故我们的结果显示PTEN表达下调诱导了EMT的发生,从而增强了细胞的迁移、侵袭能力。为了寻找PTEN的上游调节因子,进一步阐释TRAIL耐药的分子机制,我们使用target scan软件进行了调节PTEN的miRNAs的预测,根据根据target scan预测软件的结果,采用RT-PCR方法检测了231细胞和231T细胞中miR-21,miR-221,miR-222,miR-23b-3p and miR-214的表达水平,发现相较于MDA-MB-231细胞,TRAIL耐药后miR-21、miR-221及miR-222的表达水平明显上调。其中,miR-21的上调最为显著,231T细胞中miR-21的mRNA水平约是231细胞的140倍,其次为miR-221,上调约90倍。随后我们采用瞬时转染法抑制了231T细胞中miR-21的表达,进行MTT分析及PTEN表达的检测。结果显示miR-21的表达下调后,231T细胞对TRAIL的耐药没有逆转,PTEN蛋白的表达水平无改变,因此我们考虑miR-21没有参与TRAIL的耐药,在231T细胞中,不是PTEN的上游调节者。随后根据RT-PCR结果,我们对升高水平位居第2位的miR-221进行分析。我们仍然采用瞬时转染法抑制231T细胞中miR-221的表达,并经RT-PCR验证其转染效率。转染后细胞称为231T-si221,空白对照为231T-n。转染成功后我们分别从mRNA水平及蛋白水平检测PTEN的表达,结果显示无论是mRNA水平还是蛋白水平,PTEN的表达都明显上调,因此,我们得出结论,TRAIL耐药可以上调miR-221的表达,而PTEN是miR-221的靶基因。为明确miR-221是否在TRAIL耐药过程中发挥作用,我们用MTT法分析了231T-n与231T-si221细胞对rhTRAIL的药物敏感性。数据显示敲除miR-221后可以部分恢复耐药细胞对rhTRAIL的敏感性,231T细胞的耐药性得到部分逆转,随后我们采用western blot进行了之前所检测的EMT相关标志性蛋白的检测,包括N-cadherin、fibronectin、vimentin及转录因子Snail的表达水平,发现miR-221表达下调后,以上蛋白水平均明显下调,EMT过程得到逆转；而随后的transwell试验亦证实miR-221表达水平下调后,耐药细胞的迁移、侵袭能力下降,较对照组相比,P值均小于0.01,差别有显著统计学意义。所有这些结果表明,miR-221通过其靶基因PTEN诱导了TRAIL耐药及EMT的发生过程,并增强细胞的迁移、侵袭能力。结论1.TRAIL耐药的MDA-MB-231细胞系构建成功,其形态学与MDA-MB-231细胞不同；2. TRAIL耐药的细胞出现EMT, EMT使得细胞的迁移、侵袭能力增强：3.在231T细胞中,miR-221通过其靶基因PTEN部分诱导了MDA-MB-231细胞对TRAIL的耐药、EMT并增强了细胞的迁移、侵袭能力。意义1.揭示了TRAIL耐药及细胞侵袭能力增强的部分分子机制；2.证实了在TRAIL耐药的乳腺癌细胞中PTEN是miR-221的靶基因；3.为临床应用TRAIL及逆转耐药提供理论基础。