论文部分内容阅读
Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是天然免疫中重要的模式识别受体(Pathogen recognized receptor,PRR)。TLR7亚家族是TLRs中重要的成员之一,由TLR7、TLR8和TLR9组成,分布于细胞内涵体,能识别细菌或病毒核酸,并通过髓样分化蛋白88(Myeloid differentiation factor88,My D88)依赖性和β干扰素诱导型含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β,TRIF)依赖性信号通路,在抗病免疫反应中起重要作用。罗非鱼(Oreochromis niloticus)是我国淡水养殖的优良品种,每年养殖产量约占世界总产量的一半。但近年来的病害问题给我国罗非鱼养殖造成重大经济损失。为了解罗非鱼的免疫系统,探究其抗病免疫机制,本研究通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)获得尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)TLR7亚家族基因及其信号通路相关基因TRIF和含TIR结构域接合子蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)的c DNA,并对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)技术分析上述基因在健康个体及无乳链球菌感染(Streptococcus agalactiae)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)刺激后的组织表达;构建重组真核表达载体,分析上述基因在人(Homo sapiens)胚肾293T细胞的定位及对核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)的激活作用。本实验研究结果如下:1.尼罗罗非鱼TLR7亚家族基因的克隆和表达分析尼罗罗非鱼TLR7(Gen Bank accession no.MT338568)、TLR8(Gen Bank accession no.MT338569)和TLR9(Gen Bank accession no.MT338570)c DNA全长分别为5172bp、3704 bp和3343 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为3162 bp、3111bp和3237 bp,分别编码1053、1036和1078个氨基酸。SMART软件分析显示,TLR7、TLR8和TLR9编码的蛋白质分子均具有TLRs的典型结构特征。氨基酸序列同源性分析显示,尼罗罗非鱼TLR7、TLR8和TLR9均与快乐东方鲷(Astatotilapia calliptera)相似性最高(98.09%、89.67%和95.45%)。组织表达分析表明,TLR7、TLR8和TLR9m RNA在尼罗罗非鱼11个组织/器官中均有表达,TLR7 m RNA在脑中表达量最高,TLR8和TLR9 m RNA在脾脏中表达量最高。人工感染无乳链球菌后,TLR7 m RNA表达水平在肠、鳃、脾、肾和血液中均出现显著上调,且在感染8 h时达到峰值;TLR8m RNA的表达水平在肠、鳃、脾和肾脏中出现显著上调,在血液中出现下调趋势;TLR9 m RNA表达水平在肠、鳃和肾脏中显著上调,最早(8 h)在肠中出现最高表达。LPS刺激后,TLR7和TLR9 m RNA表达均在肠中出现下调,在肝、脾和肾脏中显著上调;TLR8 m RNA表达水平仅在LPS刺激5 d时在肾脏中显著上调。Poly I:C刺激后,TLR7和TLR9 m RNA表达水平在肠、肝、脾和肾脏中上调表达,最高表达量出现在肝脏中;TLR8 m RNA表达水平在肠、肝和肾脏中显著上调,在脾脏中下调表达。以上研究表明,TLR7亚家族基因在免疫应答中发挥作用,参与尼罗罗非鱼抗病免疫反应。2.尼罗罗非鱼TLR7亚家族信号通路相关基因的克隆和表达分析尼罗罗非鱼TRIF(Gen Bank accession no.MT199561)和TIRAP(Gen Bank accession no.MT338571)c DNA全长3135 bp和3913 bp,ORF分别为1 653 bp和876bp,分别编码550和291个氨基酸。与其他物种的氨基酸序列比对分析显示,TRIF和TIRAP具有TIR结构域3个信号框(Signaling box)的典型结构。氨基酸序列同源性分别显示,尼罗罗非鱼TRIF与布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)TRIF相似性最高(94.00%);尼罗罗非鱼TIRAP与快乐东方鲷相似性最高(92.78%)。组织表达分析表明,TRIF和TIRAP m RNA在尼罗罗非鱼11个组织/器官中均有表达,均在肌肉表达量最高。无乳链球菌感染后,TRIF和TIRAP m RNA表达量均在肠、鳃、脾和肾脏中上调,而血液中TIRAP出现下调。LPS诱导后,TRIF和TIRAP m RNA表达量均在肝和脾脏中上调,在肠中表达量下调;TIRAP表达量在肾脏中刺激8 h时出现最大峰值。Poly I:C刺激后,TRIF表达量在肝脏和脾脏中均在刺激8 h时出现峰值,在肾脏中显著下调;TIRAP m RNA表达量在肠中出现下调趋势,在肝、脾和肾脏中表达量上调。以上研究表明,TRIF和TIRAP基因在尼罗罗非鱼抗病原体免疫机制中发挥重要作用。3.尼罗罗非鱼TLR7亚家族及其信号通路相关基因的功能初步分析为探究TLR7、TLR8、TLR9、TRIF和TIRAP基因的功能及其在信号通路中的作用,构建了上述基因的真核表达载体,转染293T细胞,进行亚细胞定位和双荧光素酶报告分析实验。亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼TLR9在细胞质和细胞核中均有分布,TLR8、TRIF和TIRAP均定位于细胞质中,TLR7在293T细胞中未出现明显荧光信号。双荧光素酶报告分析显示,在293T细胞中过表达TLR7、TLR8和TLR9对NF-κB活性无明显影响,但与My D88共转染后均可显著增强My D88介导的NF-κB活性;在293T细胞中过表达TRIF能显著增加NF-κB的活性,过表达TIRAP对NF-κB的活性无明显影响。以上结果为深入研究尼罗罗非鱼TLR7亚家族及其信号通路相关基因的功能奠定了基础。