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研究背景异位骨化(heterotopic ossification,HO)是指在正常的骨骼系统之外的软组织中发生真正成骨的病理性过程。根据发病原因一般分为两大类:遗传性的异位骨化(hereditary HO)与获得性的异位骨化(acquired HO)。遗传性的HO以进行性纤维增生性骨发育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP)最为典型,虽然发生率低,但是其病情呈进行性且不可逆转,最终严重威胁患者的生命。而获得性的HO是临床常见的一种并发症,常继发于严重的外伤、烧伤、脊髓损伤、脑损伤等,其中又以外伤后HO最多见,因为发生机制仍不十分清楚,且发生率呈逐年升高趋势,所以逐渐引起重视。目前临床上针对获得性HO的治疗措施有限:非甾体类抗炎药及放射治疗被用作临床上常用的两种预防性治疗措施,其适应症、治疗时机、最终效果仍不十分明确。如果预防失败,HO病人面临的选项一般只能是手术切除治疗,但手术损伤本身易引起HO复发,所以对获得性HO目前亟待解决的问题是寻找有效的治疗和预防措施,而这就要求我们对HO的机理有个更深刻的理解。在发病机理方面,目前认为HO的形成必需满足三个条件:1)触发因素(创伤);2)异常微环境;3)能分化为软骨和成骨的前体细胞或干细胞。有证据提示:创伤/炎症环境通常伴随着低氧,而HIF-lα是一个关键的低氧依赖性的转录因子。更重要的是,有部分证据显示,抑制HIF-lα的表达能有效防止或抑制HO发生,但具体机制不明。于是猜想HIF-lα可能参与介导异常免疫反应(AIR)。事实上,创伤诱导的AIR可能是HO发生的重要机制,因为AIR可能创造适宜HO的微环境或者HO所必须的前提条件。近年来免疫系统的作用被越来越多的关注,不管是T淋巴细胞、B淋巴细胞还是巨噬细胞、肥大细胞以及相关炎症因子都被证明在HO进程中扮演着不可或缺的角色。间充质干细胞是一类来源于中胚层的成体干细胞,由于其在体外培养可以诱导分化为多种细胞,被广泛应用于组织工程和再生医学领域。目前大部分学者认同间充质干细胞是HO形成的主要细胞来源。基于以上认知,也为验证上述猜想,本课题组利用前期建立的HO模型—Nse-BMP4转基因模型,经CTX损伤肌肉可以诱导HO形成,验证是否可以通过HIF-lα抑制剂(PX-478)来抑制HO。通过检测外周血WBC情况来分析抑制HIF-lα是否通过抑制AIR来起作用的,进一步明确治疗机理。研究方法1.将从美国西北大学(Northwestern University)引进的Nse-BMP4转基因小鼠模型进行配种扩繁并鉴定;2.成年的BMP4转基因小鼠(6-8周)用心脏毒素(CTX,100ng/100ul)损伤左后肢肌肉后随机分为对照组和实验组,每组5只,对照组PBS处理,实验组给予HIF1α抑制药(PX-478(Apex Bio),25mg/kg),然后在处理的不同时相(1周、2周、4周)处死,取损伤部位组织;3.X线检测:将处理4周后的小鼠进行X线拍片(德国BRUKER,MS FX PRO)观察损伤部位HO的形成情况,从而判断PX-478能否有效抑制HO的发生;4.提取外周血:将成年的wt小鼠与BMP4转基因小鼠各随机分成4组,每组4只,分别给予不同的处理(损伤给药组、损伤给PBS组、未损伤给药组、未损伤给PBS组),然后在处理的不同时相(1周、2周、4周)分别进行眼球静脉取血;5.测外周血WBC:用血细胞分析仪(日本SYSMEX,XS-800i)检测wt小鼠与BMP4转基因小鼠在不同处理后不同时相的白细胞计数情况;6.提取血清检测:从眼球静脉取出的血中分离出血清,通过ELISA试剂盒(R&D systems,DAC00B)检测ACTA(激活素A)的表达情况;7.免疫荧光染色:通过HIF1α抗体检测PX-478对HIF1α的抑制效果,通过各免疫细胞的标记物(巨噬细胞-IBA1、M1型巨噬细胞-CD16/32、中性粒细胞-LY6G、B细胞及活化的T细胞-CD45R)检测各免疫细胞的表达情况,以及检测ACTA在组织中的表达;8.WB实验:通过WB实验检测损伤部位ACTA的表达情况。研究结果1.异常免疫反应可能介导了HO的发生:在Nse-BMP4转基因小鼠模型中发现,在损伤早期(1-2周),外周血白细胞的数量较wt小鼠显著上调,而在损伤后期(3-4周)白细胞数量反而明显下降;提示在Nse-BMP4转基因小鼠损伤早期免疫反应增强,而后期免疫反应减低(或者被抑制);2.X片结果显示HIF1α抑制剂PX-478可以有效抑制HO的形成;3.HIF1α抑制剂PX-478治疗结果提示,在损伤早期不管是在外周血中还是在损伤部位,白细胞的数量都明显减少,说明PX-478可以抑制免疫炎症反应。结论1.异常免疫反应促进HO的发生;2.抑制HIF1α可以抑制异常免疫反应;3.炎症反应相关的Activin A/HIF1α信号轴可能参与调控HO进程。