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目的：全世界范围内原发性肝细胞癌（HCC）的死亡率居于第3位，丙型肝炎病毒（HCV）感染是导致慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的重要病因之一。HCV感染的成年患者60%~85%迁延为慢性持续性感染，其慢性化率明显高于HBV感染的慢性化率（5%~10%），严重威胁着人类的健康。近期的研究认为病毒蛋白与宿主细胞的相互作用，导致细胞重要信号通路异常激活，引起细胞异常增殖与分化，是HCV感染后慢性化，并导致HCV相关肝硬化、肝癌等疾病发生的重要机制。E1蛋白是HCV编码的包膜糖蛋白之一，是病毒颗粒的重要组成部分，其C-末端疏水区域通过与内质网连接，呈现多种生物学功能。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)是真核细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，胞外信号经过MAPKs途径转导至胞内并引起胞内反应，调控下游信号分子的表达。MAPK激酶信号通路的异常活化影响细胞的生长、分化、凋亡等过程，参与人类多种疾病如：炎症、肿瘤等的发生与发展。ERK1/ERK2信号转导通路是经典的MAPK通路，在细胞周期由G1期至S期的进程中具有重要调控作用。目前研究证明，核心蛋白能够通过激活STAT3、MAPK、Wnt/β-catenin等多种信号通路，促进细胞异常增殖、恶性转化等病理改变，进而导致HCV感染后肝损伤的发生。然而E1蛋白在HCV相关疾病中的作用并不清楚，本实验将表达HCVE1蛋白的Ad-E1重组腺病毒感染人肝癌细胞株SMMC-7721和Huh7细胞，形成体外过表达E1蛋白的细胞模型，进而研究E1蛋白对肝癌细胞增殖与迁移能力的影响，并探讨E1蛋白对Wnt/β-catenin、MAPK等信号通路的调控，为HCV致病机制的研究奠定基础。方法：用HEK293细胞扩增编码HCVE1、E2、NS3蛋白的腺病毒Ad-E1、Ad-E2、Ad-NS3和编码GFP蛋白的对照腺病毒Ad-GFP，通过RT-PCR和Westernblot方法，分别在转录和翻译水平鉴定HCVE1、E2、NS3基因的表达。应用上述腺病毒感染SMMC-7721、Huh7细胞后，通过细胞增殖实验筛选促增殖效应最明显的病毒蛋白；将筛选到的Ad-E1感染SMMC-7721、Huh7细胞，应用MTS、结晶紫、Brdu实验检测细胞的增殖情况，并通过流式细胞仪观察其对细胞周期的影响；应用Transwell迁移实验观察E1蛋白对肝癌细胞迁移能力的影响。Westernblot检测E1蛋白对肝癌细胞Wnt/β-catenin及MAPK信号转导通路的影响；RT-PCR检测c-Myc、cyclinD1、c-Jun、c-Fos基因的表达。结果：采用HEK293细胞成功扩增得到高滴度的Ad-E1、Ad-E2、Ad-NS3腺病毒，可有效感染SMMC-7721细胞，并在转录和翻译水平检测到HCVE1、E2、NS3基因的表达。细胞计数、MTS、结晶紫、Brdu检测细胞增殖实验均证实，Ad-E1感染的SMMC-7721和Huh7细胞较对照组增殖速度加快；细胞周期结果表明：Ad-E1感染组细胞34.38%处于S期，明显高于Ad-GFP(27.32%)对照组（p<0.05）；Ad-E1感染组穿过Transwell小室的细胞明显高于Ad-GFP对照组（p<0.05）。Westernblot结果显示：Active-β-catenin在实验组与对照组中的表达没有明显差异，而Ad-E1感染组p-ERK蛋白表达量增高，与细胞增殖相关的MAPK/ERK下游基因c-Myc、cyclinD1、c-Jun、c-Fos在转录水平表达上调。结论：体外过表达HCVE1蛋白可以明显促进人肝癌细胞株SMMC-7721和Huh7细胞的增殖及SMMC-7721细胞的迁移，其促增殖作用可能与MAPK/ERK信号通路的活化相关。目的：HCV是导致肝细胞肝癌的主要致病因子，核心蛋白是其编码的一种多功能蛋白，是病毒核衣壳的主要组成成分，并参与HCV的复制及病毒颗粒的组装和释放。HCV核心蛋白可以促进DNA的合成、改变细胞周期的进程、促进细胞的增殖和转化，进而导致肝癌的发生与发展。HCV核心蛋白通过调控Wnt/β-catenin信号通路上游分子，激活经典Wnt途径，进而加快细胞增殖速率。Wnt信号通路的抑制因子SFRPs，在正常情况下可以抑制该通路的活化，但当SFRP启动子区CpG岛高甲基化时，其表达受抑制从而导致Wnt信号通路的异常激活。人间皮瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等均与SFRPs基因CpG岛甲基化修饰相关。本实验旨在探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰抑制SFRPs的表达，从而活化Wnt信号通路，导致HCV相关的HCC发生。方法：用HEK293细胞扩增编码HCV核心蛋白的重组腺病毒（Ad-Core）和对照腺病毒（Ad-GFP），并在转录和翻译水平鉴定Ad-Core对HCV核心基因的表达。用扩增的高滴度腺病毒感染SMMC-7721细胞，采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因，采用5-氮杂-2′-脱氧胞苷（DAC）去甲基化处理细胞，检测SFRPsmRNA的表达变化；提取Ad-Core或Ad-GFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞基因组DNA，采用甲基化特异性PCR(MSP)和DNA甲基化特异性测序，检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度，Westernblot检测甲基化转移酶Dnmts的表达。结果：Ad-Core可有效感染SMMC-7721细胞，在转录及翻译水平均高效表达核心基因；在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中，SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低,经甲基化转移酶抑制剂DAC处理后其表达量得到部分回升（p<0.05）；甲基化测序结果显示：SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰；甲基化转移酶Dnmt1，Dnmt3a表达量增加（p<0.05）。结论：HCV核心蛋白可以通过增加Dnmt1，Dnmt3a的表达，促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰，参与HCV相关疾病的发生。