【摘 要】
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TRPV6通道对Ca2+具有高度选择性,主要负责Ca2+由胞外向胞内的主动跨膜运输,能维持机体的钙稳定,而钙是家禽蛋壳生物矿化过程中最为关键的矿物元素,能直接影响蛋壳品质。但至今关于TRPV6通道在家禽上的报道不多,在家禽上的报道也仅限于鸡。因此,本研究利用RT-qPCR、PCR扩增直接测序法、子宫组织Ca2+浓度测定等方法研究了TRPV6基因的组织表达谱以及该基因SNPs对蛋壳品质的影响,研究了
【基金项目】
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国家自然科学基金项目,项目名称:IP3Rs通道调控蛋鸭蛋壳品质的效应机制研究,项目编号:31760663；
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TRPV6通道对Ca2+具有高度选择性,主要负责Ca2+由胞外向胞内的主动跨膜运输,能维持机体的钙稳定,而钙是家禽蛋壳生物矿化过程中最为关键的矿物元素,能直接影响蛋壳品质。但至今关于TRPV6通道在家禽上的报道不多,在家禽上的报道也仅限于鸡。因此,本研究利用RT-qPCR、PCR扩增直接测序法、子宫组织Ca2+浓度测定等方法研究了TRPV6基因的组织表达谱以及该基因SNPs对蛋壳品质的影响,研究了鸭产蛋循环中TRPV6基因组织表达水平及其对鸭子宫Ca2+浓度的影响、TRPV6与钙转运相关基因m RNA表达水平的调控影响等研究工作。本文主要结果如下:1、RT-qPCR检测结果显示TRPV6和SLC4A4 m RNA在43周龄三穗鸭不同组织中均存在不同程度的表达,TRPV6基因的表达丰度依次为肺脏＞子宫＞大肠＞心脏＞胰脏＞肝脏＞胸肌＞腺胃＞肾脏＞十二指肠＞小肠＞肌胃＞脾脏;SLC4A4基因的表达丰度依次为肺脏＞胰脏＞子宫＞大肠＞心脏＞肾脏＞肝脏＞脾脏＞十二指肠＞腺胃＞小肠＞肌胃。2、PCR扩增直接测序法在TRPV6基因第2内含子发现g.81465153 C＞G和g.81465176A＞G突变分别对蛋壳重和蛋重有显著有影响（P＜0.05）,在第3外显子发现同义突变g.81465450 T＞C;3个SNP位点联合产生5种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重有显著影响（P＜0.05）,对蛋重有极显著的影响（P＜0.01）;在SLC4A4基因第24外显子发现同义突变g.15125097 C＞T,在内含子25发现g.15132523 G＞A突变对蛋形指数有极显著影响（P＜0.01）,在内含子26发现g.15135079 G＞A突变;3个SNP位点联合产生4种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重有极显著的影响（P＜0.01）;两基因聚合后6个SNP位点联合产生8种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重和蛋重均有显著影响（P＜0.05）;表明TRPV6和SLC4A4基因新发现的3个SNP位点联合和两基因聚合6个SNP位点联合均对蛋重和蛋壳重有显著效应,可作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。3、RT-qPCR检测TRPV6基因在鸭产蛋循环不同时期各组织中的表达水平,并测定不同时期子宫的Ca2+浓度,两者进行相关性分析。结果表明:大肠和子宫中TRPV6基因的表达量在蛋壳钙化过程中（16 h）达到极显著的最大值（P＜0.01）;小肠和十二指肠TRPV6基因的表达量在0 h极显著的高于2～16 h（P＜0.01）,肾脏中TRPV6基因的表达量在0 h和5 h显著高于2 h和16 h（P＜0.05）;而子宫的Ca2+浓度在0～16 h呈上升趋势,在蛋壳钙化过程（16h）达到极显著最大值（P＜0.01）;相关性结果表明,2 h子宫TRPV6基因的表达量与子宫Ca2+浓度呈显著负相关（P＜0.05）,5 h心脏和肺脏中TRPV6基因的表达量与子宫Ca2+浓度呈显著正相关（P＜0.05）;16 h子宫Ca2+浓度与心脏、肾脏和小肠中TRPV6基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）,试验表明了鸭蛋壳形成过程中TRPV6基因对子宫、肾脏和肠道的钙离子转运均具有一定的作用,为进一步研究TRPV6基因在蛋壳形成过程中影响钙离子转运的调控机理提供参考和理论依据。4、RT-qPCR检测钙转运相关基因在鸭产蛋循环不同时期各组织中均有表达;基因表达变化规律分析发现,相关基因在肾脏、大肠和子宫中从0 h至16 h内表达量持续上升;在小肠和十二指肠中0 h至16 h表达量持续下降。相关性结果表明,在0 h,子宫Ca2+浓度与IP3R2和KCNJ15基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）,IP3R2与KCNJ15基因的表达量呈显著正相关（P＜0.05）;在2 h,TRPV6与KCNJ15基因的表达量和子宫Ca2+浓度均呈显著负相关（P＜0.05）,IP3R3与SCNN1G基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）;在5 h,KCNJ15与SCNN1G基因的表达量呈显著正相关（P＜0.05）;在16 h,子宫Ca2+浓度与SCNN1G基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）,与SLC4A9基因的表达量显著正相关（P＜0.05）,IP3R1和IP3R3基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）,PRKCA和SCNN1G基因的表达量呈显著正相关（P＜0.05）,与SLC4A9基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）,SCNN1G和SLC4A9基因的表达量呈显著负相关（P＜0.05）;表明TRPV6基因在鸭子宫中表达会对子宫的Ca2+浓度产生一定的影响从而改变胞内IP3R1、IP3R2、IP3R3、KCNJ15、SCNN1G、SLC4A9和PRKCA基因m RNA的表达,进一步揭示了TRPV6基因表达调控鸭子宫内Ca2+释放的机制存在差异。
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