真菌性角膜感染对视力有严重的损害,尤其在以农业人口为主的发展中国家,发病率逐年增加。为有效的降低致盲及致残率,早期确诊是制定合适治疗方案的关键。临床上传统的诊断方法主要是刮片镜检和真菌培养法,但是不能进行菌种鉴定和需时较长是它们的不足之处。 本实验建立两个多重PCR体系(体系1和体系2),对真菌性角膜炎4种主要致病菌属DNA进行检测,并观察其特异性。对所建立的多重PCR反应体系进行了优化,利用临床培养菌株验证该体系的可行性。同时探索简单有效的真菌DNA的提取方法。通过对比传统的诊断方法,评价PCR体系诊断真菌性角膜炎的有效性。 材料和方法 两个多重PCR体系对真菌性角膜炎九种主要致病真菌(腐皮、串珠、木贼、禾谷镰孢菌,烟、黄、黑曲霉菌,牵连青霉菌和新月弯孢菌)DNA进行检测,并观察该体系对人类基因组及其他眼部常见致病微生物DNA的检测结果。 利用镰孢菌和青霉菌标准菌株模板DNA稀释液梯度对两个多重PCR体系进行优化,选择合适的各组分用量和循环参数。紫外分光光度计测定纯化模板DNA质量浓度,根据测定值将DNA进行系列稀释,检测反应体系的灵敏度。 利用9种标准菌株的生理盐水菌丝稀释液模拟临床刮片标本,优化后的多重PCR反应体系扩增分别由异硫氰酸胍、SDS、CATB、Triton-x100和NaOH等5种裂解法提取的真菌模板DNA,根据紫外灯下观察扩增产物条带的亮度,比较几种真菌DNA提取方法的优劣。利用临床角膜刮片标本验证所选择的模板DNA提取体系。