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本文采用聚合酶链式反应(PCR)扩增已合成并克隆入pMD18-T载体中的25个AA残基的Hepcidin,酶切后将其插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichiapastoris酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-Hepcidin,转化克隆宿主菌DH5α,经DNA序列分析后,取阳性转化子转化酵母宿主菌KM71,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,0.5%甲醇诱导表达。Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达水平,又通过重组蛋白的体外抑菌活性实验检测目的蛋白的生物活性。
结果显示,所设计合成的基因片段正确插入了pPIC9K,成功的构建了重组表达载体pPIC9K-Hepcidin,DNA序列分析说明目的基因插入的正确性。Tricine-SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中Hepcidin表达量达到最高。不同拷贝数的菌株的诱导表达实验对比发现,重组蛋白最高可占到上清总蛋白的87.1%,其表达量最高可达187.3mg/L。
由此得出的结论是:可在Pichiapastoris酵母表达系统中实现Hepcidin的有效表达。