Ag-Zn-Ca-Si纳米介孔颗粒控制根管内粪肠球菌感染的应用研究

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研究目的:(1)采用模板法制备载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒(Ag-Zn-MSCNs),检测纳米颗粒的各项理化性质,并筛选出可稳定释放最适银锌原子配比的纳米颗粒;(2)评价载有最适银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒在牙本质小管中的渗透性、体外抗粪肠球菌浮游菌效果、生物相容性、对牙本质显微硬度的影响以及抑制牙本质片生物膜的能力;(3)评价载有最适银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒在比格犬根管内对粪肠球菌感染的预防作用。实验方法:第一部分:采用模板法合成载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒(Ag-Zn-MSCNs)。使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)和透射电镜(TEM)观察纳米颗粒的形貌特征。使用Brunauer–Emmett–Teller和Barrett–Joyner–Halenda(BET和BJH)分析法通过氮气吸附-脱附等温线检测纳米颗粒的比表面积、孔体积和孔径分布。使用能量衍射光谱仪(EDS)分析纳米颗粒中银、锌、钙和硅元素的组成。同时,在Tris-HCl中通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定银、锌、钙和硅元素的累计释放量。在双蒸水中测定载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒的p H值变化。第二部分:将牙本质片浸泡于纳米颗粒悬浊液中,通过被动超声振荡的方式来评价材料在牙本质小管中的渗透性。采用菌落计数法测试载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒对浮游态粪肠球菌的抗菌能力。使用CCK-8试剂盒评价载银锌钙硅纳米介孔颗粒的生物相容性。将牙本质片与粪肠球菌菌液共培养30天后,取出牙本质片置于载银锌钙硅纳米介孔颗粒糊剂中孵育7天,7天后使用FE-SEM观察纳米颗粒在牙本质片上抗粪肠球菌成熟生物膜的作用。同样,将牙本质片与纳米颗粒糊剂共同孵育14天,通过比较处理前后牙本质显微硬度的变化,评价材料对牙本质硬度的影响。第三部分:对比格犬双侧下颌第二、第三前磨牙进行机械预备,预备后分别将载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒的悬浊液、氢氧化钙糊剂、氯己定溶液、生理盐水随机置于比格犬根管中。使用超声振荡根管后封闭髓腔一周。一周后,将粪肠球菌悬浊液置于根管中,随后使用玻璃离子封闭髓腔。拍摄根尖X线片观察各组根尖周组织的病变情况,每两周一次。八周后,对实验牙及其周围牙槽骨行方块切除,将收集的样本制备成组织切片后进行染色。采用苏木精-伊红染色(HE staining)观察根尖周组织的病理变化。使用Brown&Brenn染色法观察细菌在牙本质小管中的分布。使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法监测根尖周组织一定面积内破骨细胞的数目。实验结果:第一部分:成功制备出载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒(MCSNs,Zn10-MCSNs,Ag0.5-MCSNs,Ag0.5Zn3-MCSNs,Ag0.5Zn10-MCSNs)。通过FE-SEM观察材料,发现该纳米颗粒近似球形,直径约100 nm。TEM图像显示纳米颗粒具有良好的纳米孔和纳米通道结构。BET和BJH检测发现纳米粒子具有高比表面积和2-4 nm中孔结构。EDS和ICP-AES实验结果均表明银、锌、钙和硅元素已成功负载到纳米颗粒中,并且筛选出可稳定释放最适银锌原子比(1:12)的纳米钙硅介孔颗粒(Ag0.5Zn10-MCSNs)。所有载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒均呈碱性p H值。第二部分:观察FE-SEM图片发现该材料能在超声驱动下渗透进牙本质小管中;所有载银组纳米颗粒均对浮游态粪肠球菌具有显著的抗菌效果,其中Ag0.5Zn10-MCSNs组效果最好。所有载有不同银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒均具有良好的生物相容性。通过电镜观察,相比于MCSNs组,载银锌的纳米钙硅介孔颗粒在牙本质片表面具有较强的抑制粪肠球菌生物膜的作用。此外,检测发现被该材料处理过的牙本质片的显微硬度值并未降低。第三部分:通过对X线片进行影像学分析发现Ag0.5Zn10-MCSNs组和CHX组的平均射线可透区显著小于空白对照组。HE染色发现Ag0.5Zn3-MCSNs组和Ag0.5Zn10-MCSNs组均具有降低根尖周组织炎性浸润的趋势,且预防比格犬根管内粪肠球菌感染的能力接近2%CHX。通过Brown&Brenn染色和TRAP染色观察到Ag0.5Zn10-MCSNs组和2%CHX组减少了细菌对牙本质小管的入侵,但并未减少根尖周破骨细胞的数量。结论:(1)本研究成功使用模板法制备出了载有最适银锌原子比的纳米钙硅介孔颗粒(Ag0.5Zn10-MCSNs)。该纳米颗粒近乎球形,直径约为100 nm,具有高比表面积特性,不仅能稳定释放银锌元素,而且其释放的银锌原子比能达到抗粪肠球菌的最适银锌原子比(1:12)。(2)Ag0.5Zn10-MCSNs在体外对粪肠球菌浮游菌表现出最佳的抗菌活性,具有良好的生物相容性,并且可以渗入牙本质小管中,在牙本质片上具有良好的抑制粪肠球菌成熟生物膜的作用。(3)载Ag-Zn-Ca-Si纳米介孔颗粒在比格犬根管内对粪肠球菌感染均具有良好的预防作用,其中Ag0.5Zn10-MCSNs组纳米颗粒的预防作用优于氢氧化钙,且与2%CHX组的预防作用接近,有望成为一种新型的根管内消毒药物。
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