研究表明,亚急性瘤胃酸中毒(SARA)导致瘤胃屏障功能受损,但SARA损伤瘤胃上皮屏障的分子机制并不清楚。本论文将从组织、细胞及分子层面系统研究SARA对瘤胃上皮屏障功能的影响,并探索SARA损伤瘤胃上皮细胞紧密连接的细胞信号传导机制。1.高谷物饲喂诱导试验性SARA的发生试验选用10头装有永久性瘤胃瘘管的去势公山羊,随机分为饲喂全粗料的对照组(Hay；0%谷物;n=5)和饲喂高谷物的处理组(HG；65%谷物;n=5),连续饲喂7周。每周晨饲后的0、2、3、4、6、8和12 h连续采集瘤胃腹囊部瘤胃液监测瘤胃pH值的变化,收集其中第0、3、6和12h的瘤胃液待测挥发性脂肪酸,收集其中第6h的瘤胃液待测脂多糖(LPS)浓度,采集晨饲后6h的颈静脉血检测外周血液中LPS浓度。结果显示,在第1、2、3、6和7周,晨饲后12h之内,瘤胃pH值小于5.8的时间大于4h,可以初步推断在第1、2、3、6和7周,高谷物饲喂成功诱导SARA的发生。在整个饲喂周期内,与对照组相比,高谷物饲喂显著降低(P<0.05)瘤胃pH值、乙酸浓度及乙丙比,显著升高(P<0.05)瘤胃内丙酸、丁酸及游离LPS的浓度。主效应曲线(PRC)分析瘤胃生理参数随饲喂时间变化的总体趋势显示,在高谷物饲喂的第一周,瘤胃各项生理参数急剧变化,之后有一个逐渐适应和恢复的过程,但是从第5周开始又继续之前的变化趋势。在整个饲喂周期内,在全粗料饲喂的所有山羊外周血液中都未检测到游离LPS。在试验的第1和2周,在高谷物饲喂山羊的外周血中也未检测到游离LPS,但从试验的第3周开始在高谷物饲喂的部分山羊外周血液中检测到游离LPS,从第5周开始,在所有高谷物饲喂山羊的外周血中都检测到游离LPS。结果表明,高谷物饲喂成功诱导本试验中的山羊发生SARA,同时在长期饲喂的过程中,SARA的发病有一个发生、适应、继续发生的过程。2.SARA对山羊瘤胃上皮屏障功能的影响利用试验1中的山羊,在第50天饲喂后4-5小时屠宰采样。屠宰前采集颈静脉血用于测定外周血中游离LPS的浓度同时收集瘤胃液测定pH值、挥发性脂肪酸、乳酸及LPS,采集瘤胃腹囊部的瘤胃乳头用于石蜡切片、扫描及透射电镜观察,同时采集瘤胃腹囊部的瘤胃上皮用于测定细胞因子及紧密连接蛋白的表达。结果显示处理组的pH值显著低于对照组(P<0.001);处理组总挥发性脂肪酸、丙酸、丁酸及乳酸浓度皆显著高于对照组(P<0.05),但乙丙比及乙酸浓度显著低于对照组(P<0.05)；与对照组相比,饲喂高谷物日粮后,瘤胃液中的游离LPS浓度显著升高(P<0.001);在处理组山羊外周血液中检测到游离LPS浓度达到0.80士0.20 EU/mL.而对照组的外周血液中未检测出LPS,提示LPS从消化道易位进入血液。组织切片结果显示：与对照组相比,处理组瘤胃上皮角质层呈明显脱落和损伤,瘤胃上皮乳头长度、角质层厚度都显著升高(P<0.05),而颗粒层厚度显著降低(P<0.05)。电镜结果显示：高谷物日粮组的瘤胃上皮角质层细胞出现明显坏死及脱落;颗粒层及棘状层的细胞间连接明显被破坏;部分个体显示有瘤胃微生物进入瘤胃上皮细胞间隙：颗粒层、棘状层和基底层细胞出现明显的损伤和坏死现象。实时定量PCR及免疫印迹结果显示：与对照组相比,饲喂高谷物组山羊瘤胃上皮claudin-4(P=0.003).occludin(P<0.001)和ZO-1(P<0.001)的mRNA表达水平显著降低,而紧密连接蛋白claudin,的mRNA表达水平显著升高(P=0.001);同时,高谷物饲喂也导致瘤胃上皮claudin-4(P=0.042).occludin(P=0.008)和ZO-1(P=0.001)的蛋白表达显著降低,而claudin-1蛋白表达水平显著升高(P=0.022);免疫荧光结果表明,在全粗料饲喂组,紧密连接蛋白claudin-1.claudin-4和occludin位于山羊瘤胃上皮细胞边缘并呈网格状,而高谷物饲喂导致瘤胃上皮紧密连接蛋白出现大量降解,正常结构被破坏;相关性分析发现,高谷物组山羊紧密连接蛋白的变化与瘤胃上皮细胞因子TNF-α和IFN-γ表达的上调密切相关。上述结果表明：长期高谷物饲喂诱发的SARA导致瘤胃内环境紊乱,从而影响瘤胃上皮形态结构的完整性,表现为细胞间连接被破坏,各层细胞损伤和坏死,改变瘤胃上皮紧密连接蛋白的表达和分布,使瘤胃上皮屏障功能破坏,激活瘤胃上皮局部免疫反应,引发瘤胃上皮免疫稳态失衡,使瘤胃内LPS等毒性物质易位成为可能,最终影响动物生产性能。3.SARA影响瘤胃上皮紧密连接的机理初探该部分的主要目的是利用原代瘤胃上皮细胞培养技术研究低pH值和LPS对瘤胃上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响,同时初步探索MAPK/ERK1/2信号通路对紧密连接蛋白表达的调控作用。分别从三头饲喂全粗料日粮的山羊上分离得到原代瘤胃上皮细胞,生长24小时后,将培养细胞分为8组(pH7.4的对照组;pH5.5组;pH 7.4+10μg/mL LPS组：pH5.5+10μg/mL LPS组：pH7.4+20μM ERK1/2抑制剂PD98059组：pH5.5+20μM PD98059:pH7.4+10 μg/mL LPS+20μM PD98059; pH 5.5+10μg/mL LPs+20μM PD98059),每组6个重复,所有细胞培养试验重复3次。结果显示：低pH值和LPS联合处理显著升高了claudin-1和claudin-4的表达量(P<0.05),显著降低了occludin和ZO-1的蛋白表达量(P<0.05),该结果进一步印证了在体SARA对紧密连接蛋白表达影响的结果;在体试验中与对照组相比,SARA显著升高了磷酸化ERK1/2占总ERK1/2的比例(P<0.05),即SARA激活了ERK1/2信号通路；体外试验中,与对照组相比,低pH值和LPS联合处理也显著升高了磷酸化ERK1/2占总ERK1/2的比例(P<0.05);当用ERK1/2抑制剂抑制ERK1/2信号通路后,由低pH值和LPS引起的紧密连接蛋白occludin和ZO-1表达的下降得到缓解。上述结果暗示：SARA诱发的瘤胃低pH值和高浓度LPS可导致瘤胃上皮细胞紧密连接蛋白表达变化,并且激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路;而抑制MAPK/ERK1/2信号通路活化,可缓解由SARA诱发的瘤胃上皮紧密连接损伤。