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甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)是一种重要的十字花科芸薹属蔬菜作物,在对甘蓝显性雄性不育的研究和利用方面已取得一批重要的创新成果、经典遗传研究和实际应用取得突破的基础上,本论文从基因组学与转录组学两方面对该不育基因进行系统的研究。 第一部分 利用基因组学方法对显性核不育基因进行遗传定位 利用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)标记技术结合BSA(Bulked Segregant Analysis)的方法,通过甘蓝显性核不育转育获得的芥兰回交三代分离群体,获得了M3247、M3560、M3658和M3461四个与显性核不育基因相连锁的AFLP标记,其遗传距离分别为7cM、7cM、10cM和12cM。 以青花菜与芥兰杂交后代DH(Double-Haploid)群体为材料,利用AFLP技术构建了甘蓝类作物高密度遗传连锁框架图谱,图谱总图距801.5cM,包含337个AFLP标记,标记间平均距离3.6cM。 借助DH群体遗传连锁图谱,通过AFLP技术将与甘蓝显性核不育基因连锁的标记MS3247定位于DH群体第四连锁群中;并通过染色体特异性SSR标记将DH群体遗传连锁图中部分连锁群染色体定位,间接将显性核不育基因定位于第九染色体,首次对甘蓝显性核不育基因进行遗传定位。 第二部分 通过cDNA-AFLP差异显示技术对雄性不育基因在转录水平上的表达进行分析。 利用cDNA-AFLP技术,比较分析了通过转育获得的甘蓝与青花菜雄性不育材料,与其对应可育亲本植株在花蕾发育过程中基因表达的差异。通过128个引物组合分析获得约26,000个片段,其中24个差异表达片段与显性核不育基因有关,11个表现为质的差异,13个表现为量的差异。利用简并引物策略,通过进一步引物延伸,回收并测序获得11条与显性核不育基因相关的序列;同时建立了一套分离AFLP重叠片段并直接测序的技术体系。 利用NCBI和拟南芥在线数据库对获得的11条序列进行同源性分析,其中7条序列与已知基因具有较高的同源性,4条未检索到显著同源性。 利用生物信息学手段对获得的与雄性不育相关基因进行功能注释,MSll24110序列与果胶甲酯酶基因同源,与小抱子发育中脐脏体的正常分解有关;MS1620200序列与果胶裂解酶基因同源,与小抱子发育过程小抱子细胞壁的粘连有关;并提出了甘蓝显性核不育发生的可能模式及MS 1124110序列与MS1620200序列在花粉败育中的作用。 MS1615300序列与硫氧环蛋臼类基因同源,与花粉外壳蛋白及S位点识别蛋白有关;MS1620200 序列与快速碱化因子(RALF)同源,属于信号肽类保守多肽,在植物蛋白信号跨膜传导方面起重要作用;MS 1324200 序列则与雄性不育有关的花粉特异性脯氨酸富足蛋白APG前体具有较高同源性。 本论文通过对甘蓝显性核不育基因遗传定位及相关表达片段的获得,将对该基因在标记辅助育种中的进一步应用、基因的图位克隆及构建人工可调控雄性不育奠定基础。