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研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种严重危害人类健康的常见病和多发病,表现为持续性的呼吸道症状和气流受限,呼吸道症状和气流受限是由有毒颗粒或气体导致的气道和/或肺泡异常引起的。其中85%-90%COPD患者的主要诱因是吸烟。吸烟所致高氧化应激(Oxidative stress,OS)状态下肺部结构细胞的损伤/凋亡是慢性阻塞性肺病发生肺气肿,导致气流受限的病理学基础。大量证据表明香烟烟雾暴露下高OS状态触发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的肺部结构细胞损伤/凋亡,在COPD发病机制中发挥重要作用,但对于香烟暴露下肺部结构细胞中ERS强度变化和细胞损伤的具体调控机制并不清楚,因此深入阐明ERS在香烟暴露高OS状态下从细胞保护机制过渡到细胞损伤/凋亡机制的时空变化规律,有望从OS/ERS途径改变香烟暴露下细胞损伤/凋亡的命运,进而阻止/逆转吸烟相关COPD的发生。Obg样ATP酶1(Obg-like ATPase1,OLA1)基因是新近确认的一个抗OS的内源性负性调控因子,广泛表达于包括肺组织在内的不同类型组织和细胞株中;对其功能的研究发现OLA1可能是调控OS下ERS的重要靶点。前期研究发现下调OLA1基因对巯基氧化剂、H2O2处理后的细胞具有保护作用,其机制依赖于OLA1对ERS的调控。鉴于OS/ERS途径与吸烟相关COPD形成过程中肺部结构细胞的损伤/凋亡密切相关,而OLA1是OS下的ERS激活的重要调节基因,据此我们提出科学假设:“OLA1可能参与了COPD发病机制;下调OLA1通过调控OS/ERS抑制香烟暴露下肺部结构细胞的损伤/凋亡,阻止COPD的发生。”研究目标1.阐明吸烟COPD患者肺组织标本中OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度、肺功能受损程度的相关性;2.阐明香烟暴露大鼠COPD模型肺组织标本中OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度及肺功能的相关性;3.阐明OLA1调控OS/ERS参与香烟暴露下肺部结构细胞的损伤的分子机制。研究方法1.收集胸外科手术的肺组织标本,分为三组:非吸烟肺功能正常组、吸烟肺功能正常组、吸烟COPD组,采集患者临床基本资料及肺功能,免疫组化检测肺组织中OLA1、OS标志物SOD、MDA和ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达水平,并探讨OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度、肺功能受损程度的相关性。2.构建香烟诱导COPD大鼠模型,实验分为对照组和香烟COPD组,采集两组大鼠肺功能,免疫组化检测大鼠肺组织中OLA1、OS标志物SOD、MDA和ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达水平,并探讨OLA1表达水平与OS水平、ERS活化程度、肺功能受损程度的相关性。3.体外培养A549细胞,5%CSE不同时间点刺激A549细胞,检测OLA1表达变化对香烟暴露下细胞OS状态的影响(SOD、MDA),Western blot法检测香烟暴露下OLA1、ERS相关蛋白(GRP78、CHOP)表达变化。4.siRNA下调A549细胞OLA1表达,5%CSE不同时间点刺激A549细胞,检测香烟暴露下细胞OS水平(SOD、MDA),Western blot法检测香烟暴露下ERS相关蛋白(GRP78、CHOP)表达变化。研究结果1.免疫组化半定量分析结果显示OLA1、OS指标SOD、MDA及内ERS相关蛋白GRP78、CHOP在人肺组织支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中均有表达,OLA1在吸烟COPD组和吸烟肺功能组中表达明显高于非吸烟肺功能正常组(p<0.05),吸烟COPD组高于吸烟肺功能正常组(p<0.05);OS指标MDA在吸烟COPD组和吸烟肺功能组中表达明显高于非吸烟肺功能正常组(p<0.05),吸烟COPD组高于吸烟肺功能正常组(p<0.05),SOD在吸烟COPD组和吸烟肺功能组中表达明显低于非吸烟肺功能正常组(p<0.05),吸烟COPD组低于吸烟肺功能正常组(p<0.05);ERS相关蛋白GRP78、CHOP在吸烟COPD组和吸烟肺功能组中表达明显高于非吸烟肺功能正常组(p<0.05),吸烟COPD组高于吸烟肺功能正常组(p<0.05);2.OLA1在人肺组织中表达与吸烟指数成正相关(r=0.697,p<0.01);与肺功能(FEV1/FVC%)成负相关(r=-0.667,p<0.01);与OS指标SOD负相关,与MDA表达呈正相关,(r=-0.643,p<0.01;r=0.793,p<0.01);与ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达成正相关(r=0.815,p<0.01;r=0.843,p<0.01);3.免疫组化半定量分析结果显示OLA1、OS指标SOD、MDA及ERS相关蛋白GRP78、CHOP在大鼠肺组织支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中均有表达,OLA1在香烟COPD组中表达明显高于对照组(p<0.05);OS指标MDA在香烟COPD组中表达明显高于对照组(p<0.05),SOD在香烟COPD组中表达则明显低于对照组(p<0.05);ERS相关蛋白GRP78、CHOP在香烟COPD组中表达明显高于对照组(p<0.05);4.OLA1在大鼠肺组织中表达与肺功能(FEV0.3/FVC%)成负相关(r=-0.861,p<0.01);与OS指标SOD呈负相关(r=-0.934,p<0.01),与MDA表达成正相关(r=0.886,p<0.01);与ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达成正相关(r=0.817,p<0.01;r=0.737,p<0.01);5.5%CSE、1μg/mlLPS刺激A549细胞0、15min、30min、60min、120min、240min后发现与对照组相比,香烟组和LPS组A549细胞随着刺激时间的增长,细胞活性逐渐下降;6.5%CSE分别刺激A549细胞0、15min、30min、60min、120min、240min,15min后SOD活性逐渐降低(p<0.05),MDA表达量逐渐升高(p<0.05);5%CSE分别刺激下调OLA1表达的A549细胞0、15min、30min、60min、120min、240min,SOD活性亦有所下降,但下降程度明显减轻,MDA表达水平15min、30min上升随后逐渐降低;7.5%CSE处理A549细胞后OLA1和ERS相关蛋白CHOP、GRP78在15、30、60min的表达增加,120min后表达逐渐降低;5%CSE处理siRNA下调OLA1表达组A549细胞ERS相关蛋白CHOP、GRP78上述变化趋势消失,CHOP、GRP78各个时间表点达无明显增加或减少。研究结论1.与非吸烟肺功能正常组相比,吸烟肺功能正常和吸烟COPD患者肺组织标本中支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞OLA1表达明显升高,OS、ERS水平显著升高;OLA1水平与OS、ERS水平具有显著相关性;大鼠COPD模型肺组织中也显示了相似的结果,提示OLA1表达上调可能参与吸烟相关COPD的发病机制;2.5%CSE上调A549细胞中OLA1表达水平、OS、ERS水平。siRNA下调A549细胞中OLA1表达明显减轻香烟暴露诱导A549细胞OS和ERS水平,进而减少A549细胞损伤,提示OLA1通过调控OS/ERS参与COPD的发生机制。