纳豆激酶(Nattokinase, NK),隶属于丝氨酸蛋白酶家族中的枯草杆菌蛋白酶类。对于此家族蛋白酶的各方面研究都比较多,早期的一些研究人员把丝氨酸蛋白酶家族作为一个模型来研究酶的催化机制；另外一些研究者则把目光放在探究酶的底物特异性上,这些研究都使我们很好的理解了酶的特点和机制。随着结构生物学的发展,此家族蛋白酶作为酶的典型代表,很多成员的结构都被人们所相继解析。使得我们从蛋白质的晶体结构上,可以直观的分析丝氨酸蛋白酶家族,从结构基础上理解功能。一般认为,蛋白质的一级结构中包含了自身的高级结构和生物功能所必须的所有信息。这个观点也被许多实验结果所验证是正确的。但是,由于蛋白质的折叠非常复杂,人们在研究中发现,单单氨基酸排列序列就包含所有高级结构信息的蛋白质只是一部分。仅依靠一级结构,很多蛋白质并不能具有高级结构,它们从一级序列到高级结构的过程中,需要分子伴侣(Molecular Chaperone)或者分子内分子伴侣(Intramolecular Chaperone, IMC)的参与和帮助。在这些需要IMC的蛋白质中,一般是由前导肽来充当这个角色发挥作用。它们与蛋白质肽链中的成熟肽形成相互作用界面,通过它们之间的相互作用,执行帮助折叠的功能。并且在执行完协助功能以后,一般会被水解。虽然它们不存在于成熟之后的蛋白质中,但是,在蛋白质折叠中所发挥的作用,会像“烙印”一样存在于成熟肽上,使其变化永远存在于高级结构中,也就是蛋白质记忆。这种结构上的变异进而可以改变蛋白质的生物学功能,使相同一级序列的蛋白质肽链具有不同的空间结构。属于枯草杆菌蛋白酶类的很多蛋白酶都有这样的现象。虽然前人已经对此家族的一些成员做过研究,但是这些实验都是基于体外蛋白质复性的过程,而且对于NK的此方面研究还是空白。我们发现,之所以没有蛋白质自然状态下折叠的研究,主要是因为此家族成员在蛋白表达后一般为包涵体,因此只能做复性研究。我们经过实验,摸索出了一种表达NK的方法,可以直接提取和纯化到折叠完成的成熟NK,不需要体外的复性。因此,我们用这种方法进行研究,发现NK的前导肽在自然折叠中依然执行IMC的功能。并且我们经过一系列的实验,寻找IMC执行功能的过程中,最重要的一些氨基酸基团。试图揭示IMC的功能机制,为定向改造NK和具有相似机制的蛋白质提供理论基础。经过一些实验和探索,我们找到一个可以表达NK并且能够将之引导进入周质空间的质粒pET-26b(+)。这样就可以使NK在这里折叠和成熟。我们把NK的前导肽缺失,只保留成熟肽,此时所表达的蛋白质为包涵体,不能正常完成折叠,所以不能成为拥有空间结构的NK。即使对它进行蛋白质复性,也不能得到可溶的NK。同时,我们对前导肽和成熟肽进行共表达,此时可以得到正常的NK。结果证明了NK的前导肽对于蛋白质的折叠的重要性。结合家族的研究成果,我们初步推测前导肽具有IMC的功能。我们将NK和家族内数个典型成员的前导肽进行了同源比对和结构分析。整个肽链的保守性并不高,只有三段隔离的肽段显示了较高的保守性。结构分析显示,三个保守肽段一共形成四个β折叠片,而非保守区域则折叠为两个α螺旋。首先,我们以保守性为依据,在前导肽上挑选了保守性不同的三个氨基酸残基,定点突变之后,分析它们的蛋白质结构和酶活信息,发现保守性与蛋白质结构以及功能有很紧密的关系,氨基酸残基的保守性越高,突变体的结构与功能的变化就越大。其次,我们在NK的成熟肽上,挑选了两个与前导肽有氢键作用的氨基酸残基,分别进行定点突变之后,分析结构信息和酶动力学信息,同时,我们用生物信息学进行辅助研究。经过分析,我们发现在蛋白质的折叠过程中,如果成熟肽上的氨基酸与前导肽存在相互作用,比如形成氢键,那么这些氨基酸基团的变化也会影响折叠过程,并且会改变之后成熟肽的结构与功能,甚至直接阻断折叠过程。这就证明了NK的前导肽与成熟肽的相互作用,是IMC功能的关键。同时,也确定了相互作用的模式是IMC机制的重点所在。在前导肽上的点突变实验证明,对于NK来说,发生在生物体内的自然折叠,和体外蛋白质复性过程一样,伴随着蛋白质记忆现象。这对一些由于蛋白质结构变化而引起的疾病的理解和探讨起到启发作用(如蛋白质记忆疾病)。另外,我们经过实验得知,在生物体内进行折叠的蛋白质,与经过体外复性的蛋白质,在结构和功能方面存在很大的不同。我们对NK在生物体内的折叠研究,为枯草杆菌蛋白酶的这方面研究奠定了实验基础。为了更深入的研究NK的IMC机制,我们对NK的前导肽做了片段缺失,发现前导肽上的保守肽段不可缺失,否则NK的折叠受到抑制。保守肽段的氨基酸通过与成熟肽上的某些氨基酸发生氢键作用,来指导蛋白质的折叠。我们通过研究前导肽上最为保守的五个氨基酸,确定了Tyr10, Gly13, Gly34,和Gly35这四个氨基酸发挥了这样的作用。单点突变可以直接影响NK的结构和酶活性。进行多点突变实验甚至可以完全阻止成熟肽折叠。虽然我们只有一个实验对象NK,但是从枯草杆菌蛋白酶家族的研究来看,不同的家族成员之间同源性较高,各种机制的保守性较强。而且从蛋白酶的保守性来看,我们的实验和推论结果有可能对枯草杆菌蛋白酶家族成员都有不同程度的适用性。经过实验和分析,我们确定了在NK前导肽上,至关重要的一些氨基酸位点。这些氨基酸基团的变化,可以通过IMC机制,而改变NK成熟肽的结构与功能。通过对这些氨基酸的性质和位点的研究,可以有目的的对NK进行突变,使NK成为具有更高酶活性,更强蛋白质稳定性,和更广适用性的新NK,提高应用价值。同时,这样的研究策略和方法能够推广给其他一些既具有IMC,又具有应用价值的蛋白酶,增加它们的应用效用。