肠出血性大肠杆菌(EHEC)是一种重要的食源性病原菌,自1975年被首次分离接着被确认为致病菌以来,世界各地包括中国在内都有不同规模的暴发流行,可引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等全身性并发症。O157是EHEC的代表菌株,其主要毒力特征之一是引起肠上皮细胞出现黏附与脱落(attaching and effacing, AE)损伤,编码AE损伤的基因都位于细菌染色体上LEE致病岛内,其中最重要的就是eae基因,编码一个被称为紧密素的外膜蛋白。EHEC O157另外一个毒力因子是由插入到染色体上的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx),它能使感染机体器官发生病理变化,或者继发其他的临床症状甚至引起死亡。大量研究证明,紧密素和志贺毒素Stx是可以用于开发疫苗以预防EHEC感染的重要免疫原。本试验利用PCR技术从大肠杆菌EDL933全基因组中克隆了Stx1B、Stx2B、eae三段基因,经序列分析,结果与参考序列同源性达99%以上。将产物克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-Stx1B、pGEX-Stx2B、pGEX-eae,转入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达量分别约占菌体总蛋白的27%、27.7%和19.5%,且均主要以包涵体形式表达,通过切胶的方法纯化目的蛋白。纯化蛋白免疫BABL/c小鼠,利用细胞融合技术,经间接ELISA筛选和3次细胞亚克隆,Stx1B、Stx2B、eae分别获得5、5、2株杂交瘤细胞,分别命名为1G11、2H8、1B10、3A6、4B1;1B3、4B4、2C3、3D1、1C2;2D4、3B4。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定,2D4为IgM,其他均为IgG类抗体。12株杂交瘤细胞染色体数为103±5,明显多于SP2/0骨髓瘤细胞65～75条。Western blotting表明1G11、2H8、1B10,1B3、4B4、2C3,2D4、3B4与相应的GST-Stx1B、GST-Stx2B、GST-eae融合蛋白反应均能产生特异性条带,而与空载体诱导后的GST标签蛋白不反应。制备了1G11、2H8腹水单抗,采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化后,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,几乎没有杂带。ELISA叠加试验可知,1G11、2H8、1B10抗同一抗原表位,1B3、4B4、2C3抗同一抗原表位,2D4、3B4抗不同的抗原表位。12株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性;与沙门菌、大肠杆菌、牛结核杆菌、李氏杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应。亲和力分析表明,1G11、2H8、1B10,1B3、4B4、2C3,2D4、3B4 8株单抗的亲和常数均在107～109M-1之间,亲和力较高,为这些单抗敏感、稳定和快捷的检测应用提供了必要的保证。总之,12株单抗的成功制备为EHEC O157病原的快速、特异性诊断提供了诊断试剂,同时也为该病致病机理和特异性治疗的进一步研究提供物质基础,为成功研制O157疫苗积累了数据。