血吸虫病是一种由血吸虫感染、寄生而引起的严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病。在全球74个国家中有超过2亿3千万人感染血吸虫，在我国有12个省，共计452个县有血吸虫病流行。血吸虫感染可造成人体器官（主要是肝脏、肠、尿道）的器质性病变，引起肝脏虫卵肉芽肿炎症、肝硬化、肝腹水和肝昏迷，严重危害人体健康。由于血吸虫具有复杂的生活史，能不断更新自身表面抗原成份，并能对宿主免疫系统功能进行主动调节，因而拥有很强的免疫逃避能力，给血吸虫病疫苗的研制带来巨大的困难，至今还没有具有实用价值的抗血吸虫感染疫苗问世，当前控制血吸虫病的流行仍主要依赖于化学药物的治疗。吡喹酮是目前唯一有效的血吸虫病治疗药物，并在全球大规模应用。高度流行区的大量反复用药诱导血吸虫产生对吡喹酮的抗性的风险正在增加，开发新的替代性血吸虫病治疗药物显得迫在眉睫。抗体已广泛应用于科学研究与工业化生产，在生物医学领域的应用亦极具前景。以病原、组织及肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、细胞因子及其受体、激素，及一些癌基因产物等作为靶分子，利用传统的免疫方法或细胞工程、基因工程等技术制备的多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体已广泛应用于疾病诊断、治疗、免疫干预及科学研究等领域。在脊椎动物体内，抗体因能特异地与靶标分子结合，是保护器官免受病原、恶性细胞和有毒分子侵犯的天然屏障，使用抗体作为治疗药物或药物治疗的靶向载体是非常合理的选择。然而，由于鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会出现严重的人抗鼠抗体反应（HAMA），并且存在分子量大、免疫原性强、穿透力弱和稳定性差等缺点，导致抗体的应用遭受了巨大阻碍。因此，制备分子量小、免疫原性弱及易于生产和保存的新型抗体，对提高抗体的使用价值具有重要的意义。骆驼血清中存在一种天然缺失轻链的功能性重链抗体IgG(Geavy chain antibodies，HCAb)，其可变区（variable domain of the heavy chain of HCAb,VHH）与传统抗体的VH区具有相似的功能，故又称为单区抗体（Single domain antibody）或纳米抗体（Nanobody）。纳米抗体具有以下特点：1）分子量小，只有普通抗体的1/10，组织穿透能力强；2）CDR3区长，可以形成特殊的大型凸环结构，容易进入到酶活性中心的裂隙，或凹穴中，对蛋白酶的抑制作用强；3）水溶性好、易于在原核生物中进行表达与生产；4)性质稳定、能耐高温及酸碱环境；5)免疫原性低、不易引起排异反应等。因此，纳米抗体具备了作为新一代治疗性抗体的潜能。近年来，生物体内氧化还原代谢平衡已成为新药开发重要靶标，血吸虫寄生于宿主的肠系膜下腔静脉血液中，为了维持正常的生命活动过程，血吸虫需要保持自身的氧化还原平衡，并抵抗来自宿主活性氧分子的损伤。国内、外研究已证实血吸虫的氧化还原平衡单一依赖于一种多功能蛋白酶—硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR），抑制这种多功能酶的功能可导致血吸虫死亡，证实了TGR是一种非常有潜力的抗血吸虫感染药物开发靶标，发展抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（Sj TGR）的特异性化学抑制剂或抗体将有助于开发新的血吸虫病治疗药物，而抗Sj TGR的特异性抗体还可作为血吸虫病治疗药物的靶向载体。目前关于抗Sj TGR纳米抗体的研究尚未见报道，本研究构建了抗Sj TGR的纳米抗体噬菌体展示库，采用生物固相淘洗的方法筛选到展示抗Sj TGR特异性纳米抗体的重组噬菌体，确定了纳米抗体的编码基因序列，采用原核表达的方法制备和纯化抗Sj TGR纳米抗体，为研发新的血吸虫病治疗药物或方法奠定了基础。主要研究内容如下：一、抗Sj TGR新疆双峰驼纳米抗体重组噬粒库的构建与鉴定每次以500μg重组Sj TGR蛋白福氏佐剂抗原免疫青年新疆双峰驼，经前颈部皮内多点注射。首次免疫为完全福氏佐剂，加强免疫用不完全福氏佐剂，共加强免疫4次，ELISA检测末次免疫后2周骆驼血清中抗Sj TGR蛋白抗体IgG效价达到1:12800，免疫获得成功。分离免疫后骆驼外周血白细胞，提取白细胞的总RNA，再纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA。根据文献报道的数据，设计扩增编码骆驼重链抗体IgG2和IgG3两种亚类可变区基因序列的特异性引物，以Sj TGR免疫骆驼白细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，获得长度为450-500bp的DNA片段，大小均与文献中报道的IgG2和IgG3可变区基因大小相吻合。通过限制性酶切位点Sfi1/Not1将该基因片段亚克隆到噬粒pCANTab5E中，连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，构建可能包涵编码双峰驼全部重链抗体可变区基因的噬粒库，库的容量为4.5×1010CFU/mL。随机挑选20个单个菌落，抽提质粒，进行Sfi1/Not1双酶切分析，酶切产物电泳结果显示重组噬粒库重组率达到100%，是一个高质量的纳米抗体基因库。二、抗Sj TGR新疆双峰驼纳米抗体重组噬菌体的筛选与鉴定用辅助噬菌体M13KO7感染纳米抗体噬粒库的细菌，将细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，经过复制，重组噬菌体被释放出来（这个过程又称为噬菌体拯救），获得效价为4×1012pfu/mL的噬菌体展示库，总体积为8mL。以重组Sj TGR蛋白包被在12孔细胞培养板上，与重组纳米抗体噬菌体展示库的噬菌体进行反应，进行3轮固相筛选，筛选过程中Sj TGR的包被量由每孔1000μg下降到10μg，洗涤液中的Tween-20浓度上升至0.5%，经检测第3轮筛选后噬菌体的回收量比第一轮筛选的回收量增加了1000倍，目标噬菌体呈明显的富集效应。将第三轮筛选到的噬菌体感染TG1细胞，挑取单个菌落抽提噬粒，进行限制酶切分析，结果显示，第三轮筛选的噬菌体中外源性基因的含有率约为80%。挑选100个单菌落噬粒进行DNA序列分析，测序成功的噬粒有93个，含有约500bp大小外源性插入DNA片段的噬粒有69个。将此69个噬粒中的外源性插入DNA序列翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列同源性比对，69个氨基酸序列发现了3种重复序列，分别命名为VHH3、VHH54和VHH67。VHH3的基因序列长度为429bp，重复出现27次；VHH67的基因序列长度为441bp，重复出现了8次；而VHH54的基因序列长度为441bp，重复出现了2次，其余序列没有重复。3个纳米抗体均含有重链抗体可变区两个标志性的半胱氨酸残基，骨架区（FR2区）含纳米抗体特征性亲水性氨基酸F37，E44，R45，G47，C末端氨基酸序列均有GTNEVCK（IgG3亚型铰链的特异序列），所有以上特征表明此3个抗体均为IgG3亚型。三、抗Sj TGR新疆双峰驼纳米抗体原核表达与功能分析将三个纳米抗体编码基因DNA片段分别亚克隆到表达载体pET28a（+）中形成重组表达质粒VHH3-pET28a, VHH54-pET28a和VHH67-pET28a,随后分别转化到表达宿主菌BL21中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导。转化子细菌可表达出分子量约20kDa重组纳米抗体蛋白，该重组纳米抗体能与抗骆驼IgG二抗结合，具有驼源性。采用Ni-NTA镍离子金属螯合亲和层析胶从表达产物中制备出纯化的约20kDa的重组纳米抗体蛋白。免疫印迹结果显示，纳米抗体VHH3、VHH54和VHH67蛋白均能与重组Sj TGR结合。酶学分析显示纯化的重组纳米抗体VHH3对Sj TGR蛋白的硫氧还蛋白还原酶活性具有显著的抑制作用，而纳米抗体VHH54、VHH67则没有这种抑制功能，表明纳米抗体VHH3能与Sj TGR蛋白酶活性相关结构结合而抑制其功能，而VHH54和VHH67与Sj TGR的结合位点可能在非酶活性结构区。结论：本研究成功地构建了大容量的抗Sj TGR新疆双峰骆驼纳米抗体噬菌体展示库，筛选到3个能展示抗Sj TGR蛋白纳米抗体的重组噬菌体。采用原核表达的方法制备了3株纯化的抗Sj TGR蛋白的纳米抗体，其中纳米抗体VHH3对SjTGR酶活性具有显著的抑制作用。本研究为进一步获得具有血吸虫病治疗与靶向价值的抗Sj TGR纳米抗体奠定了基础。