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3-卤代-4-羟基苯甲酸是卤代羟基苯甲酸酯类化合物合成的重要化工中间体,被广泛用于除草剂、杀菌剂、染料、医药等工农业化学品的合成。同时,3-卤代-4-羟基苯甲酸也是溴苯腈、碘苯腈和多氯联苯等卤代芳烃代谢的中间产物。因此,3-卤代-4-羟基苯甲酸（如3-溴-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸）在环境中经常被检测出,对生态环境安全和人类健康产生了较大的威胁。已报道的3-卤代-4-羟基苯甲酸的微生物好氧脱卤途径只有水解脱卤和还原脱卤两种,其降解机制的研究相对缺乏,因此发现新的3-卤代-4-羟基苯甲酸降解途径,并在分子水平上阐明其代谢机制具有重要的科学意义。在大量微生物降解污染物的报道中,发现宿主体内常有多个降解基因发挥相同的代谢功能,这种降解基因的遗传冗余现象十分普遍。但是,由于传统实验方法对冗余基因研究的局限性和挖掘冗余基因选择性优势的难度,降解基因遗传冗余方面的研究十分匮乏,限制了人们对于微生物降解更深层次的认知。因此,研究污染物降解基因的遗传冗余及其赋予宿主的选择性优势具有重要意义。本实验室前期从卤代羟基苯甲酸高度污染的土壤中分离筛选到高效降解3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate,BHB）的菌株Pigmentiphagasp.H8。研究发现,BHB的降解基因受BHB的诱导表达。借助比较转录组学和比较蛋白组学研究技术,查找BHB诱导和非诱导菌株中mRNA的转录差异和蛋白质组的表达差异,并结合生物信息学分析,推测2个4-羟基苯甲酸羟化酶基因phbh1和phbh2参与了 BHB的起始降解,而基因组上第3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因phbh3只负责4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate,4-HB）的代谢。通过基因敲除实验证实了phbh1和phbh2是负责BHB降解的起始基因。借助广宿主质粒pBBR1MCS-2分别在菌株E.coli DH5α中异源表达phbh1、phbh2和phbh3,并鉴定其功能。结果显示,phbh1和phbh2编码的酶PHBH1和PHBH2可以快速转化BHB,其产物经过LC-MS和核磁共振分析鉴定为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸（Br-PCA）,而phbh3编码的酶PHBH3可将4-HB转化为原儿茶酸。此外,通过同样的方法,证实Br-PCA和原儿茶酸可被2个原儿茶酸3,4-双加氧酶PcaAB和PcaA2B2开环,分别生成2-溴-4-羧基-2,4-二烯己二酸和3-羧基-2,4-二烯己二酸。我们的研究发现了phbh1pcaAB和phbh2pcaA2B2两个基因簇介导的BHB的新的羟化途径。为了明确菌株H8中3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因phbh1、phbh2和phbh3的遗传冗余效应,本论文对它们编码的酶的酶学特性进行了研究。借助高效表达载体pET29a（+）在宿主菌E.coli BL21（DE3）中分别表达 PHBH1、PHBH2 和 PHBH3,并通过Co柱亲和层析的方法进行纯化,获得PHBH2和PHBH3的纯酶,而PHBH1纯化效果不佳。PHBH1和PHBH3的最适酶反应温度是40℃,而PHBH2的最适酶反应温度是35℃;PHBH1和PHBH2的最适酶反应pH是8.0,而PHBH3的最适酶反应pH是7.5;三者的最适辅因子都是FAD,而非FMN,最适电子供体是NADPH。酶促反应动力学数据显示:PHBH1粗酶对4-HB和BHB的Km值分别为34.8±2.4μM和22.1±1.8 μM,比酶活分别是 6.6±1.4 和 表明 PHBH1 的最适底物是BHB;PHBH2对4-HB的Km和Kcat/Km值分别是186.4±18.6 μM和（11.2 土0.7）× 10-3 μM-1 min-1,对 BHB 的Km和Kcat/Km 值分别是 43.1±3.4 μM 和（3.5±0.1）×10-1 μM-1 min-1,表明PHBH2的最适底物是BHB,而对4-HB的催化活力非常弱;PHBH3 对 4-HB 的Km和Kcat/Km值分别是 19.6±3.9 μM 和 15.0±1.9 μM-1 min-1,对BHB 的Km和Kcat/Km 值分别是 24.7±0.9 μM和（19.2±0.7）× 10-3 μM-1 min-1,表明PHBH3的最适底物是4-HB,而对BHB的催化活力非常弱。上述结果表明,PHBH1、PHBH2和PHBH3的酶学特性差异主要体现在对底物的偏好性差异,PHBH1和PHBH2主要负责BHB的代谢,而PHBH3主要负责4-HB的代谢。由于BHB和4-HB结构类似,体外酶学数据表明BHB可以通过底物竞争性结合来抑制PHBH3对4-HB的代谢活力,推测PHBH1和PHBH2的存在可以通过降解BHB来解除这种抑制效应。进一步在不同浓度BHB（0、0.5、0.75和1.0 mM）的抑制环境下,通过测定phbh1和;phbh2的单突变和双突变株菌株以及野生型菌株分别对4-HB的代谢和利用情况,发现Phbh1和phbh2的存在可以保障宿主在高浓度BHB（1.0 mM）环境下正常代谢和利用4-HB,保障宿主的代谢安全。因此,我们推测:在卤代羟基苯甲酸的污染土壤中,菌株H8受到BHB的选择性压力,phbh1和phbh2的祖先基因通过进化获得了代谢BHB的新功能,进而不仅赋予宿主利用BHB为碳源生长的能力,还可以解除结构类似物BHB对PHBH3代谢4-HB的抑制效应,保障菌株H8对环境中天然碳源4-HB的代谢安全。本研究从菌株H8中发现了 BHB的新的羟化代谢途径,并从分子水平进行阐明,丰富了卤代羟基苯甲酸的微生物降解的多样性。通过深入研究3个冗余的4-羟基苯甲酸羟化酶基因编码酶的酶学特性差异和代谢功能多样性,证实了phbh1和Phbh2赋予宿主的选择性优势——保障宿主对环境中天然碳源4-羟基苯甲酸的代谢安全,加深了人们对于微生物在复杂环境中的适应性进化的认识,为“遗传冗余赋予宿主选择性优势”的理论提供新的证据。