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目的:“制枳壳”为岭南特色炮制饮片,在广东、香港等地区被普遍应用,经发酵后蒸制而得,具有缓和烈性、行滞消胀的优势。然而目前针对制枳壳的研究仅有少数报道,其炮制机理不明。本课题旨在从胃肠动力及胃肠神经递质的角度评价制枳壳的行滞消胀作用;并以胃肠动力、胃肠神经递质的含量变化为评价指标筛选出制枳壳行滞消胀的活性部位;从Interstitial cells of Cajal(ICCs)和SCF/c-kit信号通路角度入手,探寻制枳壳行滞消胀作用可能的分子机制,从而为制枳壳炮制机理的研究提供科学依据。方法:1.从胃肠动力及胃肠神经递质角度探讨制枳壳行滞消胀作用:采用夹尾刺激复合不规则饮食方法建立功能性消化不良(FD)大鼠病理模型。造模期间密切观察并记录大鼠的体重变化、反应灵敏程度、大便情况、毛色光泽程度等日常表现。制备生、制枳壳水煎液,以枸橼酸莫沙必利为阳性药组(AC),造模成功后连续干预治疗14天。半固体糊法计算实验大鼠小肠推进率和胃内残留率;HE染色法观察胃窦组织的病理形态学改变;Elisa试剂盒检测大鼠血浆中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、神经降压素(NT)及生长抑素(SS)的含量。2.制枳壳行滞消胀活性部位(组分)筛选:水蒸气蒸馏法提取收集挥发油。过滤收集挥发油后的水提液,滤渣再加水提取一次,滤液合并。依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取,收集不同部位后制备为干浸膏;以80%乙醇为提取溶媒提取总黄酮,大孔树脂法纯化后富集,浓缩干燥。以FD模型大鼠为实验研究对象,从对胃肠动力及MTL、GAS、NT、SS分泌的影响等方面,对制枳壳的各部位(组分)进行活性筛选。3.基于ICCs和SCF/ckit信号通路初步探讨制枳壳分子作用机制:在药效研究基础上,透射电镜下观察ICCs细胞超微形态结构;Q-PCR法和Western blot法分别考察制枳壳对SCF、c-kitmRNA及蛋白水平的表达,进而从SCF/c-kit信号通路的角度初步阐释制枳壳行滞消胀作用的分子机制。4.制枳壳的HUPLC-Q-TOF-MS谱效关系研究:HPLC法建立10批生、制枳壳特征指纹图谱,以小鼠小肠推动作用为药效学评价指标,采用灰色关联及正交偏最小二乘法(OPLS-DA)进行谱-效关联分析;利用HUPLC-Q-TOF-MS初步指认生、制枳壳与胃肠动力相关的活性成分。结果:1.制枳壳对FD大鼠胃窦组织病理及胃肠动力的影响:体内动物实验结果显示,模型组大鼠胃壁四层结构(黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层)清楚,仅黏膜层、黏膜下层有轻微水肿与充血,无器质性损伤,符合功能性消化不良的病理学表现,说明FD模型成功。给药干预后,与模型组比较,各给药组胃窦组织病理现象改善;各剂量生、制枳壳水煎液对FD大鼠胃排空率均有所降低,小肠推进率有所升高,与模型组比较P<0.05,差异有统计学意义,其中制枳壳高剂量组的改善作用最为明显。2.制枳壳对大鼠血浆中SS、NT、MTL、GAS等含量的影响:药物干预治疗后,各组大鼠血浆中抑制类神经递质含量均有所降低。与模型组比较,各给药组的SS含量均降低,阳性对照组(AC)、生品高剂量组(RFA-H)、制品高(PFA-H)、低剂量组(PFA-L)的差异有统计学意义(P<0.05);NT含量均降低,差异有统计学意义(P<0.01);分别对生、制枳壳不同剂量组进行两两比较,结果发现,制品低剂量组(PFA-L)与生品低(RFA-L)、高剂量(PFA-H)均有差异,且差异具有统计学意义(P<0.01),制枳壳的作用更显著。药物干预治疗后,各组大鼠血浆中激动性神经递质MTL含量均有所增高,与模型组比较,制枳壳高、低剂量组的差异有统计学意义(P<0.05),生枳壳组差异无统计学意义(P>0.05),提示制枳壳对于MTL的调控作用更强。各组大鼠血浆中GAS明显受到抑制,与模型组比较有统计学意义(P<0.05);生、制枳壳组对比无显著性差异,提示生、制枳壳对GAS的调控作用基本一致。3.制枳壳行滞消胀作用的活性部位(组分)筛选:不同部位给药干预后,挥发油组(VO)的大鼠胃内残留率明显减低,与模型组(MOD)比较,差异有统计学意义(P<0.05),其他实验组大鼠的胃内残留率组呈现出轻微下降趋势,但无统计学意义,提示制枳壳的挥发油部位对胃排空功能的促进作用优于其他部位;总黄酮部位(FLAs)以及萃余部位(RAF)干预下的大鼠小肠推进率均呈现上升趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),提示总黄酮部位、萃余部位均可能为小肠推动的主要活性部位。4.作用机制初步探讨:Western blot结果表明,与模型组比较,制枳壳高、低剂量组和总黄酮部位均上调了 SCF和c-kit在蛋白水平的表达;Q-PCR结果显示,与模型组相比,制枳壳低剂量组和总黄酮部位促进了 c-kit mRNA的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);制枳壳高、低剂量组上调了 SCF mRNA相对表达量,且差异有统计学意义(P<0.05),总黄酮部位也上调了 SCF的表达,但无统计学意义(P>0.05)5.基于灰色关联及OPLS-DA的枳壳小肠推动作用谱效关系研究:HUPLC-Q-TOF-MS对制枳壳的定性分析中,正离子模式下,共鉴定出化合物34个;谱效分析发现,生枳壳中有7个成分峰与药效密切相关(关联度>0.75),在变量投影重要性(VIP)均>1.0的6个峰中,新圣草苷、橙皮苷、新橙皮苷与药效呈正相关;制枳壳中的药效高相关成分峰13个,其中柚皮黄素、伞形花内酯、异牡荆素、新圣草苷与小肠推动呈高度正相关性,峰19、峰26代表的未知成分亦呈高度正相关。结合基峰图及二级碎片离子数据,推导出了高相关成分花椒毒酚、异牡荆素、伞形花内酯及柚皮黄素等化合物质谱裂解规律。结论:1.生、制枳壳均能改善FD大鼠的胃肠动力。生、制枳壳在加速胃排空方面的药效且无显著差异,而在小肠推动方面,制枳壳高剂量组的小肠推动作用明显优于生枳壳。2.生、制枳壳均能降低大鼠血浆中NT、SS、GAS的表达,提高MTL的含量。生枳壳可能主要通过抑制SS、NT的分泌改善胃肠功能;而制枳壳在抑制SS、NT、GAS的同时,促进MTL的分泌,协同作用下达到调节胃肠功能的效果。3.制枳壳行滞消胀的作用与改善FD大鼠胃肠动力密切相关。制枳壳低、高剂量水煎液及总黄酮部位均可改善ICCs的超微形态、网络结构;并上调SCF/c-kit信号通路中c-kit、SCF的表达。4.谱效关系分析发现,生、制枳壳在小肠推动方面的物质基础不同,生枳壳的主要活性成分为黄酮苷类,而制枳壳的药效活性成分集中在黄酮苷元以及香豆素类。