前言 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在我国不少地区的恶性肿瘤的死亡率统计中，胃癌居于首位。侵袭和转移是胃癌的重要生物学特征之一，也是决定胃癌预后的关键因素。随着淋巴结清除术的规范和推广以及综合治疗技术的应用，胃癌的治疗效果有所提高，但对其生物学行为的判定尚缺乏有效的分子生物学指标。因此，目前为数不少的研究都在探讨特异性分子标志物，以便建立相应的分子标准，指导临床对胃癌的治疗。本研究应用免疫组织化学S-P法及RT-PCR技术检测胃癌组织及癌旁组织中肝素酶的表达情况，探讨其表达与临床病理特征之间的相互关系，以期为临床早期判定胃癌的生物学行为以及胃癌的治疗、预后提供客观有用的指标。 方法 1．应用免疫组织化学SP法检测胃癌组织肝素酶表达情况。 所有组织均来源于中国医科大学第一临床学院1999年3月-2002年8月外科手术切除标本，其中早期胃癌10例，进展期胃癌132例，癌旁组织20例。免疫组化染色方法采用霉菌抗生物素-过氧化物酶法(SP法)，第一抗体是羊抗人的肝素酶多克隆抗体，为美国DIAZYME公司产品。染色过程中采用即用型免疫组织化学超敏S-P试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司。免疫组化染色操作如下： (1)切片脱蜡和水化； K乃％H刃。室温下孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性； 橱）高温高压抗原修复； k＊免疫动物血清37℃封闭20分钟； O）肝素酶抗体4℃孵育，过夜； 的）生物素标记的第H抗体37℃孵育20分钟； O川用型S－P复合物37t孵育20分钟。每步骤间用0．01M的PB s（PH＝7．2）缓冲液洗3次，每次5分钟； 闷）新鲜配制的DAB溶液显色； o）苏木素复染，中性树胶封片。已知阳性片作阳性对照，PBS替代一抗作空白对照。结果判定：肝素酶以肿瘤细胞浆出现明显的棕黄色颗粒为阳性表达，并分级如下：阳性细胞数＜20％为（＋X阳性细胞数 20％－50％为（＋＋L阳性细胞数＞50％为（＋＋＋）。 二．RT一PC R 采用TRIzl试剂一步法从100tug冷冻胃癌组织中提取’xln－NA，Dnase处理后合成 cDNA第一链，＋ UNOI型 PCR仪行PCR扩增，取10gi PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，滨化乙锭染色。同时以p－actin作内对照。 3．统计学分析采用d检验，P＜0．肪为差异有显著性。 结 果 二．免疫组织化学肝素酶在胃癌组织中的表达 肝素酶表达定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒。20例癌旁组织均无阳性表达，早期胃癌表达率只有20％，进展期胃癌表达率较高门8．0钝h有淋巴结转移组表达率柠0．5阐）明显高于无淋巴结转移组③o．3阮X二者差异有显著性O＜o．晒人进展期胃癌随着 ·二· 癌组织侵犯深度增加，其表达率呈上升趋势（浅肌层 48．二％、深肌 层72．7％、浆膜层94．二％入统计学分析不同深度的表达具有差异 性u＜o．05人肝素酶在高、中、低分化腺癌、粘液腺癌、印戒细胞 癌的表达率分别是42．9％J2％、47．4％j5．6％36．3％，差异无 显著性（P＞o．05）。 2．RT—PCR 8例胃癌组织RT－PCR检测，5例伴淋巴结转移的胃癌有4 例肝素酶InRNA阳性表达J例无淋巴结转移者均阴性表达。 讨 论 二．肝素酶与肿瘤的关系 近年来的研究认为，肝素酶是一种葡萄耷酸内切酶，是目前已 确定的HSPG降解酶，在内皮细胞、血小板、中性粒细胞等有活性 表达，在非免疫组织不表达。本研究中，癌旁组织粘膜上皮均无表 达，与文献报道一致。 2．肝素酶与胃癌侵袭和转移的关系 大量研究资料发现，硫酸乙酷肝素蛋白多糖（HSPG）在组织 形态发生、血管形成及上皮－间皮细胞相互作用等方面发挥了重 要作用。HSPG由蛋白核心和硫酸肝素（HS）侧链构成，是ECM， 尤其是 BM的主要组成成分。因此，其相应的水解酶在肿瘤细胞 侵袭和转移过程中具有不可忽视的作用。最近，随着肝素酶基因 得以克隆，它在肿瘤发展过程中的作用越来越受到研究人员的关 注。 胃癌细胞侵袭和转移的潜能与其产生肝素酶的量密切相关口 本研究结果显示，进展期胃癌肝素酶表达明显高于早期胃癌（P＜ 0．05X因此，不难理解肝素酶晌 HS，选择性破坏分子筛屏障，是 肿瘤细胞实现侵袭和转移的重要机制之一。而且，在进展期胃癌 ·3· ＿一中随着肿瘤细胞浸润深度增加，肝素酶表达强度增加，浆膜受侵组胃癌肝素酶表达明显高于浆膜内组，统计学分析具有显著性差异，所以，可以推测肝素酶表达水平反映了胃癌的侵袭能力。同时，研究还发现伴有淋巴结转移的胃癌肝素酶表达远远高于无淋巴结?