本课题应用纳米技术成功构建了以壳聚糖为模板的硒纳米微粒(SeNPs),并通过TEM、AFM、SEM、红外光谱等各种技术手段对其进行表征,证实制备得到了平均粒径为79.88 nm,表面电荷为+29 mV的分布均匀、大小较一致的近圆形的较为稳定的纳米颗粒。在此基础上,应用制备得到的纳米硒,以雄性SD大鼠为试验动物,通过活体灌胃、肝细胞培养等三个试验,研究了SeNPs对雄性大鼠抗氧化、生殖功能的影响及毒性机理。初步探讨超营养剂量即高于营养剂量的SeNPs的添加对雄性大鼠抗氧化和生殖功能的影响,筛选出最优的添加剂量。并在毒性剂量下研究SeNPs在体内的生物学效应和作用靶器官,通过细胞活性测定、流式细胞凋亡和相关凋亡蛋白表达水平等手段检测SeNPs对体外培养肝细胞的毒性作用机理,为SeNPs的临床和生产中应用提供理论参考。试验一：选择40只5周龄的健康雄性SD大鼠,分4组,分别灌服0、0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs,每天一次,连续灌胃两周,试验结束后麻醉处死,取相关样品进行分析检测。结果表明：(1)灌胃超营养剂量的SeNPs两周后,0.2、0.4 mg/kg BW的SeNPs促进了大鼠的生长,而08mg/kg BW的SeNPs对体重没有产生显著影响。(2) 0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs灌胃处理组的IgG水平均较对照组显著升高。0.8mg/kgBW SeNPs处理组的IgM水平较对照组有显著升高。04 mg/kgSeNPs组的C3、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ均较对照组有显著升高,08 mg/kgSeNPs组的C3、C4和IL-2也较对照组有显著升高。因此三个剂量SeNPs对大鼠的免疫功能均有不同程度的促进作用,且以04 mg/kg SeNPs组最为显著。(3) 0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs处理均显著提高了血清中RT3、FT3的水平,而对血清中FT4和TSH的水平没有显著影响。此结果揭示了在超营养剂量下,SeNPs对于甲状腺功能有促进作用。(4)对血清中抗氧化指标的检测结果显示,0.8 mg/kg剂量组的T-GSH值较对照组显著升高,0.2、0.4 mg/kg剂量组H2O2的值较对照组显著降低,而三个剂量组其他指标没有显著影响。本研究结果揭示了在超营养水平下,SeNPs对血清的抗氧化能力提高的程度不太明显,但有改善的趋势,且有剂量依赖性。而对不同组织中抗氧化功能的检测结果显示,灌胃超营养剂量的SeNPs使肝脏和肾脏的抗氧化能力有所提高,且提高的幅度以肾脏较为明显,而对于心脏和睾丸的影响较小,因此,纳米硒对于各组织脏器的抗氧化反应具有组织差异性。(5)0.8mg/kgBW剂量组肺脏的湿重较对照组有显著升高,且肺脏指数也较对照组显著升高；其他各脏器指数与对照组均无显著差异。可以推测0.8mg/kgBW SeNPs对于肺脏产生了一定的毒性作用。(6)对大鼠繁殖性能的研究结果显示,0.2、04 mg/kgBW SeNPs组血清中睾酮含量较对照组没有显著差异,而0.8 mg/kgBW SeNPs处理组较对照组显著升高,说明其促进了睾酮的分泌。三个剂量组的SeNPs对于睾丸组织中LDH、ACP、AKP酶的活性均没有产生显著的影响。对精子活力和精子运动参数的检测结果显示,0.8 mg/kgBW SeNPs以下的处理剂量对于精子的活力和运动力有很好的促进作用。(7) 0.2、0.4、0.8mg/kg灌胃剂量的SeNPs使肝脏中GPX1和GPX4的mRNA表达量均较对照组极显著升高,但对睾丸中GPX1和GPX4的基因表达没有显著影响,说明SeNPs对不同器官组织的作用存在组织差异。试验二：选择40只6周龄的健康雄性SD大鼠,分4组,分别灌服0、2.0、4.0、8.0 mg/kgBW SeNPs,每天一次,连续灌胃两周,试验结束后麻醉处死,取相关样品进行分析检测。结果显示：(1)灌胃毒性剂量的SeNPs两周后,2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs均显著抑制了大鼠的生长,而且血清中肝功能指标显著升高,显示三个剂量均对大鼠产生了一定的毒性作用,且对肝脏造成了一定程度的损伤。(2)灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs两周,对大鼠的甲状腺功能没有显著性影响,4、8 mg/kgBW的SeNPs使外周血T淋巴细胞和脾脏T淋巴细胞增殖显著降低,即4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs使大鼠免疫功能受损,而2.0mg/kgBW的SeNPs则使血清中IgM、IgG、IL-6均有显著升高。(3)灌胃8.0mg/kgBW剂量的SeNPs使血清、肝脏、肾脏、心脏和晕丸组织的抗氧化能力明显降低,4.0 mg/kgBW剂量的SeNPs也使血清、肝脏、心脏的抗氧化功能受到不同程度损伤,抗氧化能力降低,体内的过氧化产物升高。并且从抗氧化指标来看,大鼠的睾丸组织较其他组织对于过量的SeNPs的耐受性稍强,其次是肾脏、心脏。肝脏对于SeNPs的毒性最敏感。(4)对脏器指数的检查结果显示：在8mg/kgBW处理组的毒性剂量下肝脏、肾脏、肺脏和脾脏指数均较对照组显著升高,而心脏指数、睾丸指数和胸腺指数则较对照组显著降低,2mg/kgBW处理剂量下的肝脏指数和肾脏指数也较对照组显著升高,4 mg/kgBW处理剂量下的肾脏指数显著升高,而胸腺指数显著降低。对脏器组织的病理检查结果显示：在8 mg/kgBW处理组的毒性剂量下,肝脏出现细胞坏死、崩解,肝窦内皮细胞肿胀,有少量淋巴细胞样细胞浸润；肾脏中肾小球萎缩并且有渐进性细胞坏死的发生；肺泡内有充血,且支气管腔上皮内膜增厚；胸腺的髓质和皮质界限不清晰,以及有炎症细胞的大量浸润；睾丸组织中曲细精管大部分退化萎缩,曲细精管管壁明显变薄甚至破裂,细胞层次减少,生精小管直径变小,各级生精细胞排列紊乱甚至缺失。2、4 mg/kgBW处理组的组织病理图片较对照组没有显著变化。对肝脏和睾丸的电镜检查发现,8mg/kgBW处理组的肝脏和睾丸细胞的细胞间界限模糊,细胞核变形,细胞内染色质浓染、边聚,呈现细胞凋亡的形态。利用TUNEL法检测肝细胞的凋亡指数,结果显示2、4、8 mg/kg BW SeNPs处理组的凋亡细胞明显较对照组多,且4、8 mg/kg BW SeNPs处理组的凋亡指数较对照组均有极显著的升高。(5)对精子质量的检查发现,精子的各项运动参数有不同程度降低,但显著提高了睾丸组织中GPX1和GPX4的基因表达量。试验三：以01、0.5、1.0、12.0、24.0.48.0μM六个不同浓度的SeNPs对BRL细胞进行培养,结果显示：(1)0.1、0.5、1.0、12.0μM浓度处理组的SeNPs对细胞活性有促进作用,而超过24.0μM浓度的SeNPs则对细胞活性有损害。(2)不同浓度SeNPs对细胞内抗氧化活性的研究结果发现,0.1、0.5、1、12μM浓度处理组的GSH-Px、SOD、T-AOC的值均较对照组有不同程度的升高,而超过24μM浓度的SeNPs使细胞内的GSH-Px和T-AOC的值显著降低,MDA的值显著升高。即大于24μM浓度的SeNPs对细胞内的抗氧化活性有损害。(3)进一步研究不同水平SeNPs对细胞凋亡的影响,结果显示,24.0μM和48.0μM浓度的SeNPs显著提高了BRL细胞的早期凋亡和晚期凋亡率,使与诱导凋亡的关键蛋白Caspase3和Caspase8的活性显著升高,而对P53的基因表达水平没有显著影响。综合上述研究结果得出：0.2和0.4 mg/kg剂量的SeNPs对大鼠的生长、免疫、甲状腺功能以及抗氧化功能有不同程度的促进作用,显著提高了雄性大鼠的生殖功能,其中以0.4mg/kgBW剂量最为显著,肝脏中GPXl和GPX4的基因表达显著上升；而灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs对大鼠生长有抑制作用,免疫功能和甲状腺功能受损,抗氧化能力也有不同程度降低,8.0mg/kgBW的SeNPs肝脏、肾脏、肺、胸腺和睾丸组织都产生了不同程度的病理损伤,且能诱导肝脏细胞的凋亡,精子的各项运动参数也有不同程度降低。对于肝细胞培养的研究发现,SeNPs可能是通过诱导凋亡的关键蛋白Caspase3和Caspase8的表达的途径来诱导肝细胞凋亡的。