苏云金芽孢杆菌内酯酶AiiA的基因表达、特性及在循环冷却水中的应用研究

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在循环冷却水系统中存在着大量的微生物,微生物的大量繁殖会带来诸如生物粘泥、腐蚀、结垢、换热效率降低等一系统的危害。传统物理化学方法抑制微生物污染的方法会带来二次污染,寻求一种更加安全有效的方法抑制循环冷却水系统微生物污染势在必行。近年来,已有研究将细菌的群体淬灭理论应用于MBR膜生物污染的控制,而将细菌群体淬灭效应引入循环冷却水系统中抑制微生物污染的研究未见报道。  为了探究更加环保有效的方法抑制循环冷却水系统中微生物污染,应用分子生物学技术构建了能高效表达群体感应淬灭酶内酯酶AiiA的基因工程菌并表达出了内酯酶AiiA,对AiiA进行了特性研究,同时将基因工程菌菌液投入循环冷却水模拟小试系统中,进行水质分析并对模拟系统的运行进行评价。开展的主要研究工作包括:  ①从循环冷却水系统生物粘泥上共分离到6株微生物,鉴定出了三株产信号分子N-酰基高丝氨酸内酯的革兰氏阴性菌,分别为沙雷氏菌属(Serratia sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium cucumis),同时筛选出了一株具有AHLs降解效应的菌株,经测序鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi)。  ②以分离出的B,thuringiensi基因组DNA为模版,克隆出群体感应淬灭酶内酯酶aiiA基因片段,将aiiA片段连接到pCzn1载体上,转化E coli TOP10筛选出阳性克隆子,阳性克隆予测序结果与预期序列100%匹配,对重组予进行双酶切,结果显示目的基因片段正确的连接到了pCzn1载体上;将重组表达质粒pCzn1-aiiA转化入E coli Arctic ExpressTM(DE3),经IPTG诱导并纯化得到内酯酶蛋白AiiA;将重组得到的工程菌命名为E.coli AE(DE3)-pCzn1-aiiA,其稳定期约为10~16h。  ③对内酯酶AiiA利用HPLC-MS/MS系统为主要检测手段,确定了以AiiA与信号分子底物C6-HSL反应前后底物浓度的减少量表征酶活性的强弱,结果显示:酶活性最大时的温度介于25℃到35℃之间;pH约为9.0时酶活性最强;5μLAiiA的最适C6-HSL降解浓度为200μg/L以内;AiiA的最佳反应时间约为20min。  ④将基因工程菌E coli AE(DE3)-pCzn1-aiiA培养至稳定期后将菌液离心上清液以1‰投入循环冷却水小试系统实验组中,同时设置对照组,对两系统中水质指标监测结果显示:加入工程菌离心上清液未对循环冷却水中pH、Cl-、Ca2+、硬度、Fe离子等指标产生显著性影响,同时工程菌液离心上清液的加入不会加剧系统腐蚀,证明了其安全性。  ⑤加入了工程菌离心上清液的实验组相比对照组浊度有了显著降低,推断是菌液中的内酯酶降解了系统中的信号分子,干扰了细菌的群体感应效应,抑制了微生物的生长,致使浊度有了一定程度的下降;且实验组中对DO的监测结果也发现,菌液中内酯酶对循环冷却水系统中微生物信号分子的降解作用引起了微生物繁殖的减缓,作用时间约为5d。对异养菌总数的监测结果显示内酯酶能有效抑制循环冷却水中微生物的生长,缓解系统内微生物污染。焦磷酸高通量测序结果表明工程菌菌液中内酯酶AiiA抑制了循环冷却水系统中革兰氏阴性菌的生长繁殖,而对革兰氏阳性菌暂未发现抑制效应。  群体感应淬灭酶对减少循环冷却水系统中微生物总量,抑制系统微生物污染具有重大意义。因其安全有效性具有广阔的应用前景,值得被继续研究并真正应用于循环冷却水系统中以控制微生物污染。
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