能源和环境问题一直以来都是人类社会关注的焦点,同时也是我国社会经济发展过程中亟待解决的重要问题。随着非可再生资源如石油、煤炭等的逐渐枯竭,开发新的可再生能源已经成为人们的迫切需求。构成植物生物质的木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源,但纤维素较低的降解效率成为制约其转化产业化的主要障碍。对各种纤维素降解微生物及其降解体系的研究,有助于深化人们对纤维素降解机理的认识,并为实现廉价高效开发生物质资源奠定理论基础。自然界中能够利用纤维素的微生物实现纤维素降解的策略呈现多样性。哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsgai 作为一种好氧的革兰氏阴性菌,对结晶纤维素有很强的降解能力,但是其纤维素降解机制既不同于已知的非复合体型纤维素酶酶系模式,也非复合型纤维小体模式。为了系统阐述该菌独特的纤维素降解机制,本论文以C.hutchinsonii为研究对象,一方面通过转座诱变筛选获得参与纤维素降解途径的基因,另一方面借助生物信息学以及转录组分析的手段找到可能与纤维素降解有关的代谢途径,通过基因敲除等手段对相关基因展开功能研究,从而为全面解析Chutchinsonii纤维素降解机制奠定基础。本文取得的的主要研究结果如下:一、发现单一β-葡萄糖苷酶CHU₃811的缺失导致菌体失去纤维素降解能力,证明该酶在Chutchinsonii纤维素的降解中发挥重要作用通过转录组数据分析,发现不同纤维素酶基因受碳源诱导的情况存在差异,其中注释为内切葡聚糖酶的CHU₁655受纤维素诱导特异性上调,而注释为β-葡萄糖苷酶CHU₃811受纤维素诱导特异性下调。对这两个纤维素酶基因进行插入失活,发现CHU₁655的失活导致菌体在葡萄糖以及纤维二糖上的生长量略有降低,而在纤维素上的生长仅出现较短时间的延迟,并不影响对纤维素的利用;而β-葡萄糖苷酶CHU₃811基因插入失活则导致菌体失去对纤维素的降解能力,同时该突变株对纤维二糖及低浓度葡萄糖的利用也出现了明显的延迟。前期对该菌不同纤维素酶基因的敲除实验表明,单一纤维素酶基因的缺失不影响菌体对纤维素的利用,而本研究发现单一 β-葡萄糖苷酶CHU₃811基因的缺失会导致其丧失对纤维素的降解利用,这也是在该菌株中首次发现单一纤维素降解酶类缺失导致菌体丧失对纤维素降解能力的例子,表明该酶组分在该菌的纤维素降解酶活性发挥中具有重要的作用。二、通过对C.hutchinsonii中葡萄糖脱氢酶基因chu₁221,chu₂315的插入失活分析,证明C.hutchinsonii特殊的葡萄糖代谢途径与纤维素降解之间存在密切的联系通过对纤维素利用缺陷突变株的生长表型分析,发现大多数纤维素利用缺陷突变株在低浓度葡萄糖培养基的生长会出现较长时间的延迟,推测低浓度葡萄糖的代谢可能与纤维素的利用之间存在一定的关系。基因组信息分析表明,与拟杆菌门其它几株菌的葡萄糖代谢途径相比,C.hutchinsonii编码非磷酸化的葡萄糖降解途径,包含完整的由β-D-葡萄糖转换为葡萄糖酸盐的代谢酶系统以及葡萄糖酸盐转运降解系统。对C.hutchnsonii基因组中两个注释为葡萄糖/山梨酮脱氢酶的基因chu₁221,chu₂315分别进行插入失活后发现二者失活均会导致纤维素利用能力的丧失以及不同程度的低浓度葡萄糖,纤维二糖生长的延迟。研究发现两蛋白分别失活后菌株外膜蛋白葡萄糖脱氢酶（GDH,Glucose Dehydrogenase）酶活比野生型出现不同程度的降低,其中△2315菌株的相应酶活基本上检测不到,证实GDH能够通过影响葡萄糖的代谢途径进而影响到纤维素利用过程,且相对于 CHU₁221（glucose/sorbosone dehydrogenase related）,CHU 2315（glucose/sorbosone dehydrogenase）可能在葡萄糖代谢中发挥更主要的功能。三、通过基因插入失活证明C.hutchinsonii中注释为SusD-like的蛋白并非纤维素降解过程所必需;通过转座子随机诱变筛选鉴定到可能与寡糖转运相关的基因簇C.hutchinsonii基因组中存在两个与Bacteroides thetaiotaomicron淀粉利用系统（starch utilization system,Sus）重要蛋白组分SusC和SusD的同源的编码基因。SusC,SusD分别参与淀粉寡糖的结合与胞内转运,从而介导了B.thetaiotaomicron对淀粉的有效利用。之前对于两个SusC-like基因的研究表明其失活对于纤维素降解没有影响。本文通过对C.hutchinsonii的两个SusD-like蛋白的编码基因(chu₀547,chu₀554 分别进行插入失活,结果表明单独失活susD-like基因对于C.hutchinsonii纤维素降解及其它碳源的利用不会造成影响。结合SusC和SusD的研究结果,由此可以说明C.hutchinsonii在纤维素利用过程中Sus-like蛋白并不是必需的,而可能需要另外的辅助蛋白。进一步利用转座子pHimarEM1介导的插入失活,建立了纤维素利用缺陷突变株库,对其中一个转座插入基因注释为未知功能蛋白CHU₃508的突变株的研究发现其所在基因簇可能编码与寡糖转运有关的蛋白;且突变株经过低浓度葡萄糖或者纤维二糖诱导以后其纤维素利用能力可以恢复,从而显示低浓度葡萄糖或者纤维二糖对于纤维素的利用可能存在诱导作用。四、筛选鉴定了一个Sigma因子调节基因簇,该基因簇在C.hutchinsonii降解纤维素过程中发挥重要的功能通过转座诱变筛选我们得到两株纤维素利用缺陷突变株MT2007以及MT2013,经过转座插入位点分析确定二者转座插入位点均为chu₀195,该基因注释为σB因子调节蛋白（sigB regulation protein,RsbU）。通过该基因的重组回补表型,证实突变株的纤维素利用缺失表型由该基因的失活导致。位于其下游的是基因chu0194（编码σF antagonist）以及chu₀193（编码anti-σ factor）,这三个基因均编码与σ因子有关的蛋白。因此,通过生物信息学分析可以推测chu₀195,chu₀194,chu₀193所编码的蛋白可能发挥类似B.subtili 中参与σF调节的三个蛋白SpoⅡE,SpoⅡAA,SpoⅡAB的作用模式,分别将其命名为ChSR,ChAAS,ChAS。结合遗传学以及体外生化试验分析结果,我们推测虽然ChAAS与ChAS在体外能够检测到一定的相互作用,但是在C.hutchinsonii细胞内这三个蛋白的相互作用关系以及参与纤维素降解调节的机制可能并不完全等同于B.subtilis,具体的作用模式还需要更深入的探讨。