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目的氡是自然界中天然存在的放射性气体,被吸入人体后,其短寿命衰变产物氡子体会释放出高能的α粒子损伤呼吸道和肺组织,同时部分氡及子体会进入血液循环作用于全身。氡及其子体被国际癌症研究机构(IARC)划归为I类致癌因素,成为吸烟之后的第二大致肺癌因素。研究表明肺癌发病风险的增高与高氡暴露相关,肺癌的比值比(ORs)随着氡浓度的升高而升高。课题组在对某矿井下空气中氡浓度监测时发现矿井下工作场所空气中氡浓度较高。且历史上曾出现矿工肺癌高发,找到氡致辐射损伤的生物标志物并探索其致病机制十分重要。方法1.在矿工经常活动的矿井下和地面办公室等工作场所距地面1.5米处布放氡探测器,采用化学蚀刻固体径迹法结合连续测量法检测一年四季工作场所空气中氡浓度,按照 International Commission on Radiological Protection(ICRP)137报告中推荐的剂量转换参数估算矿工在井下和地面工作可能因吸入氡累积的年暴露剂量;RAD7氡探测仪测量地面办公区及食堂自来水氡浓度,使用水氡释放导致内照射剂量来估算矿工因水氡所致的内照射年剂量。2.144名矿工的队列研究,72名井下矿工为研究组,72名地上矿工为对照组。采用面对面的问卷调查,调查内容包括矿工的一般情况、健康情况、从业情况、生活习惯等,结合对矿井下和地面上工作场所中一年四季空气中氡浓度的测量,使用ICRP 137号报告推荐的参数,计算出每位矿工因吸入氡及子体可能产生的累积暴露剂量。3.血常规检测指标包括淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NE)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC),血液生化指标包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等来评价血液参数。4.流式细胞术检测并比较井下和对照组矿工外周血淋巴细胞周期、细胞周期相关调控蛋白 CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA2、CyclinD1、CyclinE1 以及γH2AX蛋白的相对表达。5.microRNA芯片筛选氡暴露量不同的矿工各10名血浆中差异表达的microRNA,Real-time PCR验证144名矿工其中四种miRNA的相对表达。6.选择5名井下矿工为研究组,5名地上矿工为对照组,按年龄排序分成5组后采用RNA-seq技术分析其共有的差异表达基因;深度挖掘数据中miR-19a-3p、miR-30e-5p、miR-335-5p对应的靶基因在井下组和对照组矿工外周血淋巴细胞中的表达情况。7.使用生物信息学及统计学方法分析潜在的生物标志物之间的内在联系,探究氡致外周血淋巴细胞辐射损伤的机制。8.数据以GraphPad Prism 8.0进行统计分析,两组间比较,不符合正态分布时采用wilcoxon非参数检验,符合正态分布的采用t检验,P<0.05时表示差异有统计学意义。多组比较采用ANOVA单因素方差分析,P<0.05时表示差异有统计学意义。Pearson相关分析研究两指标间的相关关系。结果1.井下与地面上工作场所空气中氡平均浓度分别为(7.5±3.1)kBq·m-3(n井下=39)和(0.28±0.14)kBq·m-3(n地面=15),据此估算得出空气中氡的年有效剂量贡献范围分别为(4.5～84.8)mSv和(1.3～12.9)mSv。2.井下组和对照组矿工年龄、BMI、吸烟指数没有明显差异。井下组累积氡暴露高于对照组,差异有统计学意义(n井下=72,n对照=72,P<0.05)。井下组和对照组矿工氡有效照射剂量范围分别为(244～1845)mSv和(4～207)mSv。3.与对照组比较,井下组矿工外周血LYM计数、NE计数较低,差异有统计学意义(n井下=72,n对照=72,P<0.05);井下组矿工外周血血红蛋白较高,差异有统计学意义(n井下=72,n对照=72,P<0.05)。井下组矿工外周血RBC低于对照组(n井下=28,n对照=60),PLT、WBC高于对照组(n井下=72,n对照=72),差异没有统计学意义(P>0.05)。4.井下组矿工外周血淋巴细胞周期G0/G1期所占百分比高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);S期低于对照组,差异有统计学意义(n井下=72,n对照=72,P<0.05);井下组矿工外周血淋巴细胞中的CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin A2、Cyclin D1以及Cyclin E1均高于对照组,差异有统计学意义(n井下=72,n对照=72,P<0.05);井下组矿工外周血淋巴细胞γH2AX蛋白表达高于对照组(n井下=28,n对照=60),差异有统计学意义(P<0.05)。5.MicroRNA芯片(n井下=10,n对照=10)筛选出差异表达的microRNA,与对照组相比,高氡暴露组有15种microRNA表达下调,分别是hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-451a、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-5100、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-4701-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-4790-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-3976、hsa-miR-4762-5p、;11 种 microRNA 表达上调,分别是hsa-miR-488-5p、hsa-miR-1227-3p、hsa-miR-4770、hsa-miR-6724、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-1181、hsa-miR-6880-3p、hsa-miR-6796-3p、hsa-miR-3154、hsa-miR-1825。其中,差异表达倍数大于2倍的miRNA有5种,分别是hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-451a、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-335-5p。Real-time PCR验证了两组矿工外周血(n井下=72,n对照=72)血桨miR-19a-3p、miR-30e-5p、miR-335-5p、miR-451a,井下组矿工四种miRNA的表达低于对照组,结果与芯片结果一致。6.RNA-Seq技术分析结果显示,5组矿工共有的差异基因有CCL3L3、CCL3L1、105369230、CCL4L2、LAIR2、TMED7-TICAM2、LOC112268337、MC1R和S100B,其中对这些差异基因进行KEGG Pathway富集分析后涉及细胞进程、环境信息处理、人类疾病以及免疫、内分泌和发育系统等,相关的信号通路涉及Toll样受体通路、病毒蛋白与细胞因子以及细胞因子受体的相互作用、NF-kappa B信号通路等。对矿工外周血淋巴细胞mRNA测序结果进行深度挖掘,井下组miR-19a、miR-30e以及miR-335对应靶基因的表达高于对照组,但差异没有统计学意义。7.TargetScan、miRBase 以及 miRanda 预测靶基因显示,CCNA2 和 CCND1(分别编码 CyclinA2 和 CyclinD1)是 miR-19a 的靶基因;CCNE(编码 CyclinE)是miR-30e的靶基因;CDK2(编码CDK2)是miR-335的靶基因。Pearson相关性分析结果显示,CyclinA2、Cyclin D1与miR-19a呈负相关(P<0.05),Cyclin E1 与 miR-30e 呈负相关(P<0.05),CDK2 与 miR-335 呈负相关(P<0.05)。8.多重线性回归分析显示,外周血LYM计数、NE计数、外周血淋巴细胞CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin E1 的表达以及血浆miR-19a-3p、miR-30e-5p、miR-335-5p、miR-451a的相对表达均与氡累积暴露相关(P<0.05)。结论本研究首次利用基因芯片技术以及RNA-seq测序技术筛选井下矿工血样,寻找新的氡致辐射损伤潜在的生物标志物,分析不同累积氡暴露矿工的共有差异表达基因,并利用生物信息学手段探讨氡致外周血淋巴细胞辐射损伤的机制,并得到以下结论:外周血LYM计数、NE计数可能成为评价氡致辐射损伤的指标,外周血淋巴细胞 γH2AX,CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA2、CyclinD1、CyclinE1 等蛋白以及血浆中miR-19a、miR-30e、miR-335以及miR-451a等有可能成为氡辐射损伤潜在生物标志物。