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背景皮肤上皮干细胞作为种子细胞用于人造皮肤的制造和伤口修复已有多年历史,但通常所用的干细胞为单一分化潜能的表皮干细胞,无法重建任何皮肤附属器官,实现皮肤的全部功能。研究表明毛囊干细胞具有修复表皮,分化为毛发、皮脂腺、汗腺的多分化潜能,是伤口修复和人造皮肤的理想种子细胞。然而人类正常皮肤组织中,毛囊干细胞的比例极低,一根毛囊仅能提取200-400个毛囊干细胞,而临床治疗所需的毛囊干细胞通常需要百万数量级以上,原代毛囊干细胞数量远不能满足需求。而毛囊干细胞传统体外培养需要滋养层细胞及血清培养,但这样的细胞产品不能用于临床治疗,因此急需建立支持人类毛囊干细胞体外无血清无滋养层细胞的扩增技术。运用小分子抑制剂可以精确对信号通路进行激活或抑制,在细胞培养研究领域已经取得一些进展。小分子抑制剂Y-27632为Rock的抑制剂,可以促使人胚胎干细胞、角质上皮细胞增殖,抑制细胞的凋亡;A83-01可以抑制TGF-βI型受体ALK5的转录活性,协同CHIR-99021可将成熟肝细胞逆转成干细胞,A83-01协同DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在无血清无滋养层细胞的条件下能够在体外大量扩增某些上皮细胞。以上这些结果表明在细胞培养中利用小分子抑制剂可以一定程度上弥补无血清培养营养不足导致的细胞生物学性状改变,开拓干细胞培养的新局面。目前,A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632在毛囊干细胞体外无血清扩增的作用尚未见相关报道。本课题拟建立符合本实验室及贴近临床运用的人毛囊干细胞采集纯化保存的规范化流程,在此基础上研究小分子抑制剂A83-01、DMH-1、CHIR-99021、Y-27632对人毛囊干细胞体外无血清扩增的影响,为人毛囊干细胞临床应用及研究提供一定的理论基础和技术支持。目的1.建立人毛囊干细胞库及细胞采集纯化保存的规范化流程,并行鉴定;2.探索体外无血清培养人毛囊干细胞方法,优化扩增人毛囊干细胞及维持干性的条件。方法1.人毛囊外根鞘细胞获取:采用Dispase II初步消化带毛囊组织,显微镜下拔取毛囊,剔除皮脂腺,离断毛乳头,0.05%Trypsin-EDTA消化获得人毛囊外根鞘细胞单细胞悬液。免疫荧光染色观察处理前后干细胞变化。2.差速贴壁富集毛囊干细胞及原代细胞培养:利用含人I型胶原的COATING MATRIX KIT进行包被培养皿,15min差速贴壁分离毛囊干细胞,利用CNT-PR原代上皮培养液添加Y-27632进行原代细胞培养。流式分析及免疫荧光观察纯化结果。3.人毛囊干细胞的培养条件探索:分组培养毛囊干细胞,对照组培养基(CNT组)、实验组1(A83-01组)、实验组2(DMH-1组)、实验组3(A83-01+DMH-1组)、实验组4(CHIR-99021)、实验组5(A83-01+DMH-1+CHIR-99021组),CCK-8行细胞分组条件下短期培养细胞增殖速度,传代培养时,每代记录接种细胞及收细胞数目,免疫荧光染色K15细胞比例,计算细胞扩增总量及K15阳性细胞扩增情况。结果1、免疫荧光染色定位毛囊干细胞于毛囊的中段,显微外科除去毛乳头及皮脂腺,初步提高了毛囊干细胞纯化效果;2、以含人I型胶原的COATING MATRIX KIT进行差速贴壁分离毛囊干细胞,有效富集CD200+/CD49+毛囊干细胞(P<0.05),同时避免传统利用小鼠IV型胶原差速贴壁带来的异种蛋白侵入危险;3、成功在无血清、无滋养层、培养基成分限定的条件下进行原代干细胞体外培养16±3天,每根毛囊可取得4.5±0.7×104 K15阳性细胞;4、添加A83-01、Y-27632或者添加A83-01、DMH-1、Y-27632于CNT-PR培养基较单纯添加Y-27632于CNT-PR培养基或其他分组,能提高总体细胞及K15阳性细胞增殖速度,缩短扩增时间(P<0.05);5、本实验流程可在无血清、无滋养层、培养基成分限定的条件下进行毛囊干细胞的培养扩增,利于实验研究的分析和临床应用。结论:我们在避免异种蛋白或基因干扰的条件下,利用差速贴壁法纯化毛囊干细胞,在体外无血清扩增,6周内1根毛囊扩增出的毛囊干细胞可达百万数量级,贴近临床运用,并发现A83-01及DMH-1可以提高毛囊干细胞扩增效率及干性维持。