肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)作为最主要的肺癌亚型,其转移率在肺癌各亚型中居于首位。肿瘤转移是一个多步骤、级联的复杂过程,其中,肿瘤浸润是肿瘤转移的前提条件。但目前为止,肺腺癌浸润机制尚不明确。MicroRNA(miRNA)是内源性产生的非编码单链小RNA,能够以多种作用方式调控基因的表达,并且能够以调控多个基因的方式协同调控生理和病理过程。研究提示miRNA的异常表达与肿瘤恶性进展密切相关。因此,本课题旨在考察肺腺癌中异常表达的miRNA在肺腺癌浸润过程中的作用及分子机制,为阐明肺腺癌浸润机制提供新的思路。肺腺癌浸润相关miR-629-5p的发现:根据TCGA数据库的分析,我们选择了27个在肺腺癌中表达明显上调的miRNA并进行了体外transwell小室细胞迁移的筛选,结果表明miR-629-5p能够明显增强肺腺癌细胞的体外迁移能力。进一步检测49对人肺腺癌临床样本中miR-629-5p的表达,发现与癌旁组织相比,miR-629-5p在浸润性肺腺癌组织中显著高表达,而在非浸润性肺腺癌组织中无明显变化,结果表明了miR-629-5p与肺腺癌浸润的显著正相关性,进一步提示其可能在肺腺癌浸润过程中发挥了重要的促进作用。内源miR-629-5p促进肺腺癌浸润的验证:我们首先利用transwell小室比较了miR-629-5p低表达的A549细胞和miR-629-5p高表达的H1650细胞体外迁移与侵袭能力的差异,结果表明H1650细胞体外迁移与侵袭能力显著强于A549细胞。进一步通过尾静脉注射肺转移实验在裸鼠体内比较了H1650细胞与A549细胞肺转移能力的差异,结果显示,细胞注射45天后,A549组小鼠肺表面转移结节发生率为20%,H1650组小鼠肺表面转移结节发生率为100%,肺表面结节统计结果显示H1650组小鼠肺表面结节数量显著多于A549组,肺脏切片的结果显示H1650细胞具有显著的血管浸润特征,而在A549组中没有观察到这一现象。以上结果表明,与A549细胞相比,H1650细胞具有更强的肺表面结节形成能力和肺内的血管浸润能力,提示miR-629-5p具有明显的促进肺腺癌浸润的作用。过表达miR-629-5p促进肺腺癌浸润的确证:我们利用慢病毒构建了miR-629-5p过表达A549稳转株并进行体外transwell小室迁移与侵袭实验和体内裸鼠尾静脉注射肺转移实验,结果表明,与对照组相比,miR-629-5p过表达显著增强了A549细胞体外迁移与侵袭能力。体内结果显示,miR-629-5p过表达组小鼠肺表面转移结节发生率为100%,对照组小鼠肺表面转移结节发生率38.46%,肺表面结节统计结果表明,miR-629-5p过表达显著促进了A549细胞肺表面转移结节的形成,肺脏切片的结果显示miR-629-5p过表达使A549细胞具有了显著的血管浸润能力。以上结果进一步确证了miR-629-5p具有促进肺腺癌浸润的重要作用。MiR-629-5p促进肺腺癌浸润双重促进分子机制的探究:基于上述结果,我们进一步研究了外泌体与miR-629-5p以及肺腺癌浸润的相关性,发现了miR-629-5p在肺腺癌细胞中的作用机制,同时发现肺腺癌细胞来源外泌体中miR-629-5p对血管内皮细胞也具有重要的作用。首先,miR-629-5p在肺腺癌细胞中作用机制:通过蛋白质谱的分析,我们发现肿瘤转移相关蛋白PPWD1在miR-629-5p过表达A549细胞中表达显著下降,这一现象提示了其参与肺腺癌浸润过程的可能性。进一步我们在肺腺癌细胞中分别利用PPWD1 siRNAs和flag-PPWD1过表达质粒抑制和过表达PPWD1的方法在体外考察PPWD1的作用,结果表明抑制PPWD1表达显著促进了肺腺癌细胞的迁移与侵袭,而过表达PPWD1能够显著抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭,同时过表达PPWD1能够显著抑制miR-629-5p促进肺腺癌细胞迁移与侵袭的作用,临床样本的检测结果同样验证了miR-629-5p表达与PPWD1表达的负相关性。以上结果证明PPWD1表达降低在miR-629-5p促进肺腺癌细胞自身迁移、侵袭过程中发挥了关键的作用。其次,miR-629-5p在内皮细胞中作用及分子机制:利用超速离心法分离肺腺癌细胞条件培养基中外泌体并利用电镜、标志蛋白检测以及nanosight粒径检测技术对外泌体进行了鉴定,进一步检测外泌体中miR-629-5p含量发现,转移来源肺腺癌细胞外泌体中miR-629-5p的含量显著高于正常肺上皮细胞及原位来源肺腺癌细胞。这一结果提示了外泌体中miR-629-5p参与肺腺癌细胞血管浸润的可能性。在接下来的功能考察中,我们利用肿瘤细胞与内皮细胞共培养、单层内皮细胞渗透性及肿瘤细胞跨单层内皮细胞侵袭实验证明了外泌体中miR-629-5p能够通过增强单层内皮细胞的渗透性促进肺腺癌细胞跨内皮细胞侵袭的作用。检测内皮细胞渗透性相关蛋白的表达发现miR-629-5p能够显著下调非典型钙粘蛋白CELSR1的表达,进一步我们通过siRNAs抑制CELSR1表达和CRISPR-dcas9激活CELSR1表达的方法确证了其维持单层内皮细胞渗透性的能力,同时证明了CELSR1表达降低是miR-629-5p增强单层内皮渗透性的关键靶基因,临床样本免疫荧光的结果也表明了miR-629-5p表达与CELSR1表达之间的负相关性,提示了肺腺癌细胞外泌体miR-629-5p通过降低内皮细胞CELSR1表达增加内皮细胞渗透性,从而促进肺腺癌细胞血管浸润的作用。综上所述,本研究通过TCGA数据库的筛选、临床样本的分析及验证、体外体内功能考察及进一步的机制探究,首次发现了miR-629-5p具有显著的直接促进肺腺癌浸润的作用,同时揭示了miR-629-5p可以通过增强肺腺癌细胞自身迁移与侵袭能力和增加血管内皮细胞渗透性,进一步促进肺腺癌浸润的全新的双重促进作用分子机制。为阐明肺腺癌浸润转移机制提供了新依据、新思路,同时为肺腺癌的治疗提供了新靶点、新策略。