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顺铂已广泛应用于各种癌症的治疗包括三阴性乳腺癌(TNBC),主要通过破坏DNA和诱导细胞凋亡。然而,其抗癌作用往往由于癌细胞对化疗药物产生耐药性而受到限制,这是导致癌症复发和转移的主要原因之一。为了克服耐药性,顺铂常与其他药物或分子联合运用。在此,我们检测到miR-221/222在耐顺铂的TNBC细胞以及耐顺铂的乳腺癌患者中有更高的表达。靶向抑制TNBC中miR-221/222可促进顺铂诱导的细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。在携带TNBC肿瘤的小鼠体内模型中,anti-miR-221/222联合顺铂使用则抑制肿瘤生长的效果更加显著。此外,miR-221和miR-222在MDA-MB-231细胞中对提高顺铂的敏感性具有协同作用。机制方面,抑制Socs-1—Stat3—Bcl2通路和激活p53—Pten信号通路均可介导anti-miR-221/222调控TNBC对顺铂敏感性,这些发现为顺铂联合小非编码RNA化疗治疗人TNBC提供了一种新的方法。材料和方法:1、动物:动物研究得到了同济大学附属上海东方医院动物保护与使用伦理委员会的批准。6周大的雌性裸鼠由Silaike Animal Company(Shanghai,China)提供。2、细胞:人乳腺癌细胞MDA-MB-231原购自ATCC(Manassas,VA,US);耐顺铂MDA-MB-231细胞来自上海大学龙华医院的陈洪峰博士;耐阿霉素MDA-MB-231细胞则是使用浓度梯度对阿霉素处理后,从存活细胞中收集而来。3、寡核苷酸和转染:anti-miR-221、anti-miR-222和阴性对照oligos按照Exiqon(Vedbaek,丹麦)的LNA Oligo工具和设计指南设计,由GenScript(中国南京)合成。按照制造商的说明,使用来自荷兰Qiagen(Venlo)的HiPerFect转染试剂进行细胞转染。最后50nM浓度RNA低聚糖在体外实验中用于所有。4、miRNA qPCR分析:采用Trizol试剂(Invitrogen,美国)提取总RNA。按照制造商的说明,使用M&G miRNA逆转录试剂盒(miRGenes,Shanghai,China)制备miRNA的第一条互补的cDNA链,miRNA实时PCR的正向引物序列为:miR-16,5’-agcagcacgtaaatattggc-3’;miR-221,5’-agctacattgtctgct-3’;miR-222,5’-agctacatctggctact-3’;5s ribosomal RNA,5’-agtacttggatgggagaccg-3’。所有引物均由GenScript(南京,中国)合成纯化。SYBR GreenMaster的混合物是ABI产品(Applied Biosystem,Life Technologies)。采用ABI7900 HT序列检测系统(Applied Biosystem,Life Technologies)进行实时定量PCR检测。使用5s核糖体RNA进行校正。5、细胞增殖实验(CCK8)试验:准备3块96孔板,将2×10~3细胞分别种到板内,培养一段时间后,按照CCK8试剂盒操作,在细胞培养条件下染色3h,上酶标仪在波长是450nm下检测OD值。6、细胞凋亡实验:细胞在顺铂刺激下培养24-48h,然后进行Annexin V染色,并按照制造商的说明使用Annexin V-FITC/IP试剂盒(Bestbio,中国)进行流式细胞术分析。7、免疫印迹(Western blot)实验:转染anti-miRNA或control,48h后,用细胞裂解液(50mg)制备,使用10%SDS/PAGE分离。蛋白质被转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂奶粉封闭液中,摇床封闭1h。孵育一抗(1:1000),摇床上4℃孵育过夜,隔天,经1×TBST洗涤后,室温下孵育二抗(1:3000),孵育1h,ECL孵育,染色。以下抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司:anti-P27(sc-776),SOCS-1(sc-9021),c-MYC(s-40),PTEN(sc-7974),P53(sc-6243),STAT3(4904s),BCL-2(sc-492)andβ-ACTIN(sc-47778)。8、动物实验:接种1×10~6个MDA-MB-231细胞与基底膜基质混合,并注入裸鼠第四乳腺的脂肪垫(n=30)。将小鼠随机分为三组(每组10只)。空白对照组:小鼠腹腔注射0.9%生理盐水(5mg/kg体重/剂量),连续三周,每周一次,共打3次,肿瘤局部注射0.9%生理盐水(5ug in 10uL:0.5ug/uL):每72h注射一次,总共四次;顺铂组和联合组方法同上:顺铂组:小鼠腹腔注射顺铂(5mg/kg体重/剂量),肿瘤局部注射anti-miRNA-NC(5ug in 10uL:0.5ug/uL);顺铂+anti-miR组:小鼠腹腔注射顺铂(5mg/kg体重/剂量),肿瘤局部注射anti-miR-221/222(5ug in 10uL:0.5ug/uL),每隔一天测量肿瘤大小一次,并绘制肿瘤生长曲线。经过3周的实验,所有小鼠均于细胞移植后第23天处死。所有肿瘤称重,分离,并且提取RNA和蛋白质进行进一步分析。9、统计学分析:最终的结果数据均是平均值±标准差。所有的实验均重复三遍。两组间比较采用t检验法,多组间比较采用单因素方差分析的方法。当两组之间p<0.05时,认为其差异显著且具有统计学意义。实验结果:1、miR-221/222在顺铂/卡铂耐药乳腺癌中特异性上调针对乳腺癌化疗耐药复发转移的情况,对MDA-MB-231-R细胞进行miRNA表达筛选,找到TNBC中调控顺铂耐药的关键基因。在MDA-MB-231-R细胞中,发现了一个miRNA亚群,其中包括miR-221/222,其表达存在差异。除顺铂外,耐多柔比星MDA-MB-231细胞中miR-221/222表达也上调。TCGA数据库对化疗耐药乳腺癌和化疗敏感乳腺癌miRNA表达进行分析比较,发现顺铂/卡铂耐药乳腺癌患者的miR-221和miR-222表达水平明显高于化疗敏感乳腺癌患者。但是,miR-221和miR-222在其他药物(如他莫昔芬耐药和敏感乳腺癌患者)中表达无差异,表明miR-221/222在顺铂/卡铂耐药乳腺癌中特异性上调。2、anti-miR-221和anti-miR-222敲低miR-221/222后可显著促进MDA-MB-231细胞对顺铂的敏感性鉴于miR-221/222在顺铂/卡铂耐药乳腺癌中特异性上调,在MDA-MB-231-R细胞中进一步通过靶向敲低miR-221/222,通过其表达水平高低来确定miR-221/222的调控功能,随后进行顺铂治疗和细胞活力检测。结果显示,使用anti-miR-221和anti-miR-222敲低miR-221/222后可显著促进MDA-MB-231-R细胞对顺铂的敏感性,进一步运用annexin V染色和流式细胞术检测,MDA-MB-231-R细胞转染miR-221/222前后,经顺铂处理和不处理的细胞凋亡情况。在没有顺铂刺激的情况下,anti-miR-221/222与anti-NC相比细胞凋亡不显著。但是,在20uM顺铂存在下,anti-miR-221/222使MDA-MB-231细胞凋亡比例从~12%显著升高至~22%,进一步表明,anti-miR-221/222的应用促进了MDA-MB-231-R细胞对顺铂的敏感性。3、通过annexin V染色后的流式细胞术分析进一步验证,anti-miR-221和anti-miR-222在MDA-MB-231细胞中对提高顺铂的敏感性具有协同作用由于miR-221和miR-222具有相同的种子序列,可能具有相同的靶基因,因此有必要确定miR-221和miR-222在调控TNBC细胞耐药方面的作用。单独应用anti-miR-221或anti-miR–222时,MDA-MB-231细胞对于顺铂的敏感性影响不显著,当anti-miR–221和anti-miR–222联合使用时,显著提升MDA-MB-231细胞对于顺铂的敏感性。因此,anti-miR-221和anti-miR-222具有协同促进TNBC细胞对顺铂敏感性的作用,进一步通过annexin V染色后的流式细胞术分析,证实了anti-miR-221和anti-miR-222在MDA-MB-231细胞中对提高顺铂敏感性具有协同促进作用。4、在携带TNBC肿瘤的小鼠体内实验中,结果显示,anti-miR-221和anti-miR-222联合顺铂使用,能有效提升化疗药抑制肿瘤生长的效果。为了进一步确定anti-miR-221/222在TNBC细胞中对顺铂敏感性的研究,分别在裸鼠第四对乳腺脂肪垫处接种MDA-MB-231细胞,然后经腹腔注射顺铂治疗,在肿瘤局部处给anti-miR-221/222。在MDA-MB-231细胞接种23天后,处死小鼠,取出肿瘤,称重,结果显示,顺铂+anti-miR组肿瘤平均大小和肿瘤重量均小于顺铂组和对照组。表明anti-miR-221/222联合顺铂使用则抑制肿瘤生长的效果显著。5、抑制Socs1-Stat3-Bcl2通路和激活p53-Pten信号通路均可介导miR-221/222调控TNBC对顺铂敏感性为了明确miR-221/222调控TNBC对顺铂敏感性机制的研究,我们选取了两个前期我们在miR-221/222已经鉴定出来的两个靶基因:socs1、p27。在MDA-MB-231细胞中,分别转染anti-miR-221/222前后,对mRNA和蛋白水平的表达进行分析。P27和socs-1的上调与miR-221/222的敲低有关。进一步分析Stat3作为socs-1下游靶基因已经被广泛证实,anti-miR-221/222抑制其表达,Stat3在癌症中转录调控肿瘤的发生和肿瘤的耐药,其转录调控一组基因包括c-myc和bcl2,对stat3下游基因的分析表明,anti-miR-221/222能下调c-myc和bcl2,这与socs-1的上调和stat3的下调是一致的。对凋亡关键调控基因的进一步分析显示,miR-221/222靶向下调MDA-MB-231细胞中p53和pten的表达,这些结果表明,抑制Socs1-Stat3-Bcl2通路和激活p53-Pten信号通路均可介导miR-221/222调控TNBC对顺铂的敏感性。结论:1、miR-221/222在耐顺铂的TNBC细胞中呈现高表达。2、miR-221/222的抑制促进了TNBC细胞对顺铂的敏感性。3、anti-miR-221和anti-miR-222在TNBC细胞中对提高顺铂的敏感性具有协同作用。4、在携带TNBC肿瘤的小鼠体内成瘤实验中,证明了anti-miR-221和anti-miR-222联合顺铂可进一步提高TNBC细胞对顺铂的敏感性。5、anti-miR-221/222调控TNBC对顺铂敏感性机制是通过抑制Socs-1-Stat3-Bcl2通路和激活p53-Pten信号通路实现的。