癌性疼痛是肿瘤患者最常见的症状之一。大部分患者的癌性疼痛是由肿瘤侵犯骨骼、神经或其他器官所致,部分抗肿瘤疗法或肿瘤有创的诊断方法也是癌痛产生的原因。据报道,约75-90%的肿瘤患者会有癌痛经历,而且超过50%的癌痛患者无法有效控制癌痛；约1/4的新诊断的肿瘤患者,1/3正在接受治疗的肿瘤患者,3/4晚期肿瘤患者伴有癌痛。癌痛在肿瘤发生转移的患者中更加普遍,超过80%的骨转移的肿瘤患者伴随有癌痛。癌痛的治疗在肿瘤治疗、护理以及改善肿瘤患者生存状况中具有重要的作用。越来越多的研究证据表明不能有效控制的癌痛严重影响了肿瘤患者的生活质量,而有效地控制癌痛与患者的生存期明显相关。临床上肿瘤医师多用阿片类药物控制癌痛,虽然阿片类药物有效,但是往往伴随有严重的不良反应,比如便秘、尿潴留、恶心、呕吐、呼吸抑制以及精神错乱等。因此,寻找新的治疗癌痛的方法,提高癌痛患者的生活质量,十分迫切,成为当前急需解决的问题。中医药以及补充替代医学疗法是非侵害性、无创的疗法,且毒副作用较小,一般被用做疼痛标准“三阶梯方案”的辅助疗法。越来越多的研究证实了中医药尤其是中医外治法治疗癌痛具有一定的疗效,尤其是中药联合“三阶梯口服药”可明显增强“三阶梯口服药”的止痛效果。消癥止痛外用方是中国中医科学院广安门医院肿瘤科的院内制剂,主要由血竭、青黛、冰片、乳香、没药、延胡索等药物组成,具有化瘀通络、解毒抗癌的作用,临床上用于中晚期癌性疼痛。我们前期的临床研究表明,消癥止痛外用方配合“三阶梯口服药”治疗癌痛可获得协同止痛的作用,与单纯口服“三阶梯口服药”相比,止痛时间明显缩短,明显提高癌痛患者的生活质量,而且不良反应较小。然而,消癥止痛外用方治疗骨癌痛的作用及分子机制尚未见报道,揭示其作用及分子机制可揭示新的治疗癌痛的药物靶点,可为开发新型的癌痛治疗药物奠定重要的理论基础。目的：观察消癥止痛外用方对骨癌痛大鼠模型的治疗作用,进一步探讨消癥止痛外用方治疗骨癌痛的分子机制。方法：(1)制备消癥止痛外用方凝胶膏剂,并观察消癥止痛外用方凝胶膏剂对大鼠皮肤的透皮作用：以延胡索乙素为标准,采用改良Franz扩散池法进行实验,同时用HPLC测定样品的含量。(2)将体重为150-180g的Wistar雌性大鼠随机分为假手术组和骨癌痛组,如前所述进行造模；骨癌痛组再随机分为高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组、安慰对照组和阳性对照组。分别于造模前和造模后第3、6、9、12、 15、 18、21天进行机械性痛觉过敏测试；分别于造模前和造模后第2、5、8、 11、14、 17、20天进行热痛觉过敏测定。于造模后第21天,对大鼠后肢进行X线摄片及mirco-CT检查,并对各组动物胫骨进行骨密度检测,使用Prodigy双能X线骨密度仪对胫骨进行扫描,小动物软件分析BMD和BMC含量,以评估消癥止痛外用方对骨癌痛大鼠模型局部骨组织的影响。并于造模后第21天,对各组大鼠左侧胫骨进行HE染色,观察消癥止痛外用方对骨癌痛大鼠模型中肿瘤细胞浸润以及对局部骨组织的影响。(3)通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)免疫组化法检测各组大鼠成骨细胞活化状态,以及用碱性磷酸酶(BAP)免疫组化法检测破骨细胞活化状态。用ELISA法检测各组大鼠血清Ⅰ型胶原羧基端原肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRAP5b)以及骨钙素(osteocalcin)水平,并以CD68为标志物,采用免疫组化的方法检测各组大鼠左侧胫骨中巨噬细胞的阳性比例,并分别以TR-PCR以及Western blot法检测各组大鼠骨组织中RANKL/RANK/OPG信号通路相关分子如RANKL、OPG、RANK、PTHrP及IGF-1mRNA和蛋白表达水平,以及炎症介质IL-8、M-CSF及TNF-α的mRNA及蛋白表达水平。(4)采用ELISA法检测血清中PAR2/TRPV1通路的主要炎性介质胰蛋白酶(trypsin)、TNF-α、IL-1β的表达水平,采用RT-PCR和Western blot法检测骨癌痛大鼠体内DRG神经元上PAR2/TRPV1通路相关分子PAR2、TRPV1、PKC-γ和PKA的mRNA和蛋白表达水平以及脊髓中神经递质c-Fos、GFAP、IBA1及CGRP mRNA和蛋白表达水平。结果：(1)消癥止痛外用方24小时的累计经皮渗透率和速率分别为20.20%,0.7441μg·cm-2·h-1。说明消癥止痛外用方凝胶膏剂对大鼠皮肤的渗透作用行为符合零级动物学模型且离散度较小,经皮渗透作用较为理想,为以后消癥止痛外用方的作用机制研究提供了可靠的药物制剂。(2)安慰剂组骨癌痛大鼠机械痛阈值和PWL逐渐下降,最低评分分别为1.83±0.15和4.57±0.28,而高、中、低剂量消癥止痛外用方组均较安慰剂组明显提高机械痛阈值和PWL,二者有统计学差异(P<0.05)。安慰剂组X线、Mirco-CT以及BMC和BMD测量结果显示骨组织破坏明显,伴全厚度双皮质骨损失,高、中、低剂量消癥止痛外用方组能明显降低骨癌痛大鼠骨质破坏,提高骨密度(P<0.05)。各组骨组织病理显示：消癥止痛外用方可减少骨组织中肿瘤细胞的侵袭。(3)与安慰剂组相比,消癥止痛外用方组能显著降低骨癌痛大鼠模型血清CTX、TRAP5b以及osteocalcin (p<0.05),亦能显著降低TRAP阳性细胞比例(p<0.05)和BAP阳性细胞比例(p<0.05),而且消癥止痛外用方能显著降低骨癌痛模型大鼠局部骨组织巨噬细胞的阳性比例(p<0.05)。消癥止痛外用方能显著下调RANKL、RANK、PTHrP及IGF-1 mRNA和蛋白表达水平(p<0.05),以及炎症介质IL-8.M-CSF及TNF-α的mRNA及蛋白表达水平(p<0.05)。相反,消瘤止痛外用方能显著提高OPG的mRNA及蛋白表达水平(p<0.05)。而且上述消癥止痛外用方的作用具有剂量依赖性。(4)与安慰剂组相比,消癥止痛外用方组能显著降低PAR2/TRPV1通路的主要炎性介质胰蛋白酶(trypsin)、TNF-α、IL-1β的表达水平(p<0.05),能显著抑制骨癌痛大鼠体内DRG神经元上PAR2/TRPV1通路相关分子PAR2、TRPV1、PKC-γ和PKA的mRNA和蛋白表达水平(p<0.05),并能明显下调脊髓中c-Fos、GFAP、IBA1及CGRP mRNA和蛋白表达水平(p<0.05)。结论：1.消癥止痛外用方可有效缓解骨癌痛；2.消癥止痛外用方可通过调控RANKL/RANK/OPG信号通路及炎症反应,抑制骨癌痛模型中破骨细胞活化,减少骨质破坏；3.消癥止痛外用方可通过调控PAR2/TRPV1信号通路,抑制骨癌痛大鼠外周敏化和中枢敏化。