茄科植物天仙子(Hyoscyamus niger L.),是一类能够产生托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)的重要药用植物,其中莨菪碱、东莨菪碱是被广泛使用的抗胆碱制剂。近年来,代谢工程的兴起使得遗传改造TAs生物合成途径成为可能,而代谢工程依赖于对该途径的分子生物学和生物化学研究。高等植物功能基因的转录翻译特点与其调控机制一直是植物基因工程领域比较热门的研究方向。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制,并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。启动子按其转录方式的不同可以分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动外源基因的组成型表达往往会造成资源的浪费,同时异源蛋白的过量积累也会造成植物代谢紊乱,不能正常生长。因此研究组织特异性启动子和诱导型启动子更具有价值。茉莉酸(jasmonie acid,JA)及其甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是重要的信号转导分子,JA、MeJA及其他JA衍生物统称为茉莉酸类(jasmonates,JAs)。这些信号分子影响各种植物过程,包括伤害,非生物胁迫,防御昆虫和寄生的病原体。此外JAs还能够在转录水平上影响植物次生代谢。MeJA作为诱导子影响次生代谢物合成的研究越来越受到人们的关注。就目前为止,国内外已有大量的关于JAs诱导产生植物次生代谢物的报道,这些研究多数是结合基因工程、功能基因组等分子生物学技术进行研究。本研究以天仙子为试验材料,研究氮甲基腐胺转移酶基因的启动子,旨在阐明启动子不同区域发挥的功能,及其初步探索启动子对MeJA的响应情况。利用high-efficiency TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)方法克隆了HnPMT基因的启动子,将启动子及用PCR方法获得的一系列5’端缺失片段与报告基因GUS融合,转化拟南芥和天仙子发根,利用50μM MeJA处理天仙子发根,发现该启动子受MeJA的诱导。对各个不同截短长度启动子的转基因拟南芥幼苗进行GUS染色及转基因发根的GUS染色石蜡切片分析,发现该启动子是根特异性启动子。主要研究结果如下:1.根据HnPMT基因5’端非编码区设计特异性引物,利用hiTALL-PCR的方法,克隆了长1207bp的HnPMT基因启动子(KU981110)。利用启动子分析网站在线预测,ATG位于转录起始位点下游79bp处。在转录起始位点上游-30/-25区有一个TATA-box(TATAAA),在转录起始位点上游-254/-359区存在多个CAAT-box,都是真核植物启动子具有的特征元件。同时又发现了参与茉莉酸甲酯响应的元件,如CGTCA-motif,TGACG-mitif和G-box;激素响应元件如AuxRR-core;SA响应元件如TCA-element;参与防御基因激活的调控元件,如MBS,TC-rich repeats,W-box,HSE,LTR.;光响应元件如Box 4,Box I site,ATCC-motif,GAG–motif,Gap-box,Sp1等,ROOTMOTIFTAPOX1,OSE2ROOTNODULE,OS E1ROOTNODULE和NTBBF1ARROLB是与根特异性有关的顺势作用元件。2.将克隆到的HnPMT最长启动子(-1128/+79)、各缺失启动子(-701/+79、-451/+79、-217/+79)及G-box突变启动子构建到植物双元表达载体p CAMBIA1391Z载体上,产物命名为pCAM-HnPMT217、pCAM-HnPMT451、pCAM-HnPMT701、pCAM-HnPMT1128、pCAM-HnPMT217-muG-box,并采用农杆菌介导法,转化拟南芥和天仙子发根。成功获得转基因拟南芥植株AP217、AP451、AP701、AP1128,转基因天仙子发根HR217、HR451、HR701、HR1128、HR217-muG-box,为后续进行该启动子功能的研究提供试验材料。3.对天仙子植株的实时荧光定量结果表明,HnPMT基因主要在根中表达,叶片中几乎不表达。进一步对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析结果表明:AP217、AP451和AP701的组织化学染色,该三种不同长度的启动子驱动的报告基因GUS,在拟南芥的叶片和根中都有表达,没有表现出组织特异性,AP1128的染色结果表明-1128/+79区段的启动子能够驱动报告基因GUS特异的在根中表达,而在叶片不表达。因此,HnPMT启动子特异性在根中表达,并且在启动子-1128/-701区之间存在根特异性元件。对天仙子发根的GUS组织化学染色和石蜡切片的分析:在所有的转基因发根中,发根的根尖和表皮层部位都没有GUS的表达,HR217、HR451和HR701发根中该三种长度的启动子驱动的报告基因GUS,在根的皮层、内皮层和维管组柱表达,HR1128发根GUS切片结果表明-1128/+79区段的启动子能够驱动报告基因GUS,在天仙子发根的内皮层和维管柱表达,而在皮层不表达。因此推断,在HnPMT启动子的-1128/-701区段有某些作用元件调控这一现象。4.对在三角摇瓶培养了28天的天仙子空白发根用50μM MeJA处理,分别处理0h、1h、6h、12h、24h,实时荧光定量分析不同处理时间点HnPMT基因的相对表达量,结果表明在24h,基因对50μM MeJA的响应最厉害,此时间点基因的表达量最高。用同样的方法处理转基因发根,处理24h后测定报告基因GUS的相对活性,结果表明:HR217、HR451、HR701、HR1128转基因发根都受到MeJA的诱导,因此HnPMT启动子是一个受MeJA诱导的启动子。进一步对启动子-217/+79区段上G-box进行定点突变,GUS酶活性结果表明:用50μM MeJA诱导,G-box定点突变后的发根GUS酶活性显著降低,降低了1.24倍,因此G-box是HnPMT启动子上响应MeJA的重要顺势作用元件。