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背景和目的肺癌根据临床治疗方案的不同,通常将其分为两种类型:非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）;前者较为多见,约占肺癌患者比例的80%,近年来,随着吸烟和各种环境因素的影响,肺癌的发病率和死亡率逐年上升,尽管一直以来有关肺癌的诊治水平不断提高,但肺癌细胞生长速度快、易转移的特点使得多数患者总的五年存活率很低。为此,从分子水平探讨肺癌的发生发展的调控机制,早期干预肿瘤的发展进程,有助于提高肺癌患者的生存率,降低其死亡率。非编码RNA（Non-coding RNA,nc RNA）生物形成机制及调控作用也开始引起研究者的关注。mi RNA已证实在转录或翻译水平调控靶基因的表达,进而在细胞的生长、发育、分化、增殖、凋亡和细胞周期等细胞生物学行为都起着十分重要的作用。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lnc RNA）是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。目前已发现lnc RNAs在多种癌症中差异表达,且参与调控多种分子途径,引起基因表达改变,调控细胞生物学行为的变化。为此,lnc RNAs的功能及相关机制研究将为肿瘤的治疗提供潜在的靶点。Lnc RNA RGMB-AS1定位于5q21.1,目前关于lnc RNA RGMB-AS1的国内外报道非常少,结合预实验结果肺腺癌标本中检测分析lnc RNA RGMB-AS1表达时发现lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌组织中呈高表达,且其表达水平均与肺腺癌的分化程度及淋巴结转移有相关性,但是lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌中的具体生物学作用及相关的分子机制仍需进一步探讨。我们的研究第一次综合分析了lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌中表达和生物学作用,并初步探讨了其肿瘤调节作用的分子机制。本研究包括四部分:第一部分:肺腺癌组织中lnc RNA RGMB-AS1表达及与临床病理学特征相关性分析;第二部分:体外调控lnc RNA RGMB-AS1表达对肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1生长、迁移和侵袭的影响;第三部分:体内调控lnc RNA RGMB-AS1表达对肺腺癌对裸鼠移植瘤生长的影响;第四部分:lnc RNA RGMB-AS1作用机制的初步研究。第一部分肺腺癌组织中lnc RNA RGMB-AS1表达及与临床病理学特征相关性分析方法1.收集了110例肺腺癌组织标本,包括110例肺腺癌组织和110例配对的癌旁正常组织标本。2.运用lnc RNA基因芯片检测肺腺癌组织和配对的癌旁组织标本中lnc RNA的表达情况。3.运用q RT-PCR检测110例标本9种lnc RNAs,其中包含5个在肺腺癌中表达上调的lnc RNAs（LOC284801,KIAA1908,XLOC008466,LINC00665 and RGMB-AS1）和4个在肺腺癌中表达下调的lnc RNAs（MAGI2-AS3,LOC100505495,LOC400550,XLOC001412）验证lnc RNA芯片结果的可靠性。4.依据lnc RNA RGMB-AS1的表达水平,并分析其与肺腺癌患者年龄、性别、TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移之间的相关性。结果1.lnc RNA芯片检测分析得到肺腺癌组织标本中差异表达的lnc RNAs有907个,其中272个（约30%）表达上调,635个（70%）表达下调。lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌组织中表达增高。2.q RT-PCR结果显示在9种lnc RNA中,验证结果和基因芯片结果一致,证实了芯片数据的可靠性。3.Lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌组织中表达上调,且相关性分析结果显示lnc RNA RGMB-AS1的表达水平与肺腺癌分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况有相关性（P>0.05）,而与病人的年龄和性别无相关性（P<0.05）。第二部分体外调控lnc RNA RGMB-AS1表达对肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1生长、迁移和侵袭的影响方法1.设计合成沉默lnc RNA RGMB-AS1表达的si RNA及无关的si RNA序列,分别使用脂质体LipofectamineTM2000进行转染对数生长期A549和SPC-A-1细胞。2.荧光定量PCR检测各实验组细胞中lnc RNA RGMB-AS1的表达变化,筛选沉默lnc RNA RGMB-AS1表达效果最佳的si RNA序列。3.CCK-8试剂和克隆形成实验检测下调lnc RNA RGMB-AS1对A549和SPC-A-1细胞细胞增殖能力的影响。4.流式细胞术检测下调lnc RNARGMB-AS1对A549和SPC-A-1细胞周期的影响。5.划痕实验用来检测下调lnc RNA RGMB-AS1对A549和SPC-A-1细胞迁移能力的影响。6.Transwell实验用来检测下调lnc RNA RGMB-AS1对A549和SPC-A-1细胞侵袭能力的影响。结果1.对比空白对照组和阴性对照组,转染lnc RNA RGMB-AS1 si RNA的四个组中si RNA1（si-lnc RNA组）的沉默作用较为明显,lnc RNA RGMB-AS1表达水平显著下调（P<0.01）。2.CCK8实验结果显示:与对照组比较,si-lnc RNA组A549和SPC-A-1细胞的生长在转染24h后出现显著抑制（P<0.05）,并且随时间抑制效果日益显著。3.克隆形成实验结果显示A549和SPC-A-1细胞中si-lnc RNA组的细胞克隆团形成明显少于NC组和Blank组,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明下调lnc RNA RGMB-AS1表达,A549和SPC-A-1细胞的生长受到显著抑制。4.流式细胞术检测细胞周期结果显示相比NC组和Blank组,si-lnc RNA组A549和SPC-A-1细胞处于G0/G1期的细胞比例显著增加,而S期细胞比例显著减少,进一步说明下调lnc RNA RGMB-AS1表达可影响A549和SPC-A-1细胞的生长。5.划痕实验结果显示si-lnc RNA组A549和SPC-A-1细胞划痕的宽度随时间延长愈合较慢,而NC组和Blank组的细胞划痕愈合较快,且具有明显统计学差异（P<0.05）,说明下调lnc RNA RGMB-AS1表达可抑制A549和SPC-A-1细胞的迁移能力。6.Transwell侵袭实验结果显示si-lnc RNA组A549和SPC-A-1细胞侵袭数与Blank组和NC组相比差异有显著性（P<0.05）,说明下调lnc RNA RGMB-AS1表达可抑制A549和SPC-A-1细胞的侵袭能力。第三部分体内调控lnc RNA RGMB-AS1表达对肺腺癌裸鼠移植瘤生长的影响方法1.设计合成针对lnc RNA RGMB-AS1的sh RNA序列及无关阴性对照sh RNA序列,构建慢病毒重组载体后,制备沉默lnc RNA RGMB-AS1表达的重组慢病毒,感染对数生长期A549-Luc和SPC-A-1-Luc细胞,得到下调lnc RNA RGMB-AS1表达的A549-Luc和SPC-A-1-Luc细胞株。2.荧光定量PCR方法检测稳定下调lnc RNA RGMB-AS1表达的A549-Luc和SPC-A-1-Luc细胞株中lnc RNA RGMB-AS1的表达水平。3.据上述lnc RNA RGMB-AS1下调水平的检测结果将A549-Luc和SPC-A-1-Luc各组处理细胞注射裸鼠右侧腋下后在1周,2周,3周,4周的时间运用小动物成像仪观察并监测裸鼠移植瘤的生长情况。4.免疫组化和Western blot技术检测移植瘤组织中Ki67的表达水平。结果1.成功制备了沉默lnc RNA RGMB-AS1表达的重组慢病毒,到下调lnc RNA RGMB-AS1表达的A549-Luc和SPC-A-1-Luc细胞株。2.在1周,2周,3周,4周的时间观察并监测裸鼠移植瘤的生长情况,结果显示sh RNA1组裸鼠移植瘤的生长较空白对照组和阴性对照组明显减慢,差异有统计学意义（P<0.05）。4周时的移植瘤体积相比空白对照组和阴性对照组明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。3.免疫组化和Western blot技术检测移植瘤组织中Ki67的表达,结果发现显示sh RNA1组裸鼠移植瘤组织中Ki67的表达较空白对照组和阴性对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。第四部分lnc RNA RGMB-AS1作用机制的初步研究方法1.UCSC分析lnc RNA RGMB-AS1序列预测可能的靶基因。2.根据分析结果构建lnc RNA RGMB-AS1第三外显子的表达载体（p Silencer3.1-Lnc-Exon3）和RGMB第一和第二外显子报告基因载体（p EGFP-N3-Exon1和p EGFP-N3-Exon2）,运用脂质体LipofectamineTM2000进行转染对数生长期A549细胞。实验分六组进行,（1）单独转染p EGFP-N3-Exon1;（2）共同转染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1;（3）共同转染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3;（4）单独转染p EGFP-N3-Exon2（5）共同转染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1;（6）共同转染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer3.1-Lnc-Exon3。3.运用倒置荧光显微镜和微量荧光分光光度计观察和检测各组细胞的荧光强度。4.q RT-PCR检测110例肺腺癌标本和对应癌旁正常组织中RGMB m RNA表达情况并与临床病理特征和lnc RNA RGMB-AS1进行相关性分析,Western blot技术检测肺腺癌标本和对应癌旁正常组织中RGMB蛋白的表达水平。5.构建pc DNA3.1-RGMB表达载体,运用脂质体LipofectamineTM2000进行转染A549和SCP-A-1细胞,western blot技术检测RGMB蛋白的的表达变化,同时比较转染lnc RNA RGMB-AS1 si RNA与过表达RGMB两细胞增殖、侵袭和细胞周期的影响。结果1.USCS序列分析结果发现lnc RNA RGMB-AS1序列的第三外显子区域与RGMB的第一和第二外显子区域存在相互作用。2.对比癌旁正常组织,肺腺癌组织中RGMB m RNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,经统计学分析显示肺腺癌组织中RGMB m RNA的表达水平与肺腺癌分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况有相关性（P>0.05）,而与病人的年龄和性别无相关性（P<0.05）。Lnc RNA RGMB-AS1在肺腺癌组织中表达与RGMB表达之间呈负相关。3.Western blot技术检测转染后各组细胞RGMB蛋白的表达变化结果显示转染lnc RNA RGMB-AS1相关的si RNA组RGMB蛋白表达明显增加,转染pc DNA3.1-RGMB组细胞,RGMB蛋白的表达量也明显增加,相对于Blank组差异具有统计学意义（P<0.05）4.微量荧光分光光度计检测转染后各组细胞的荧光强度变化,结果发现转染重组载体p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3的细胞的荧光强度相对于单独转染p EGFP-N3-Exon1组和共转染p EGFP-N3-Exon1和p Silencer 3.1组细胞的荧光强度无明显变化（P>0.05）;而转染重组载体p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1-Lnc-Exon3的细胞的荧光强度相对于单独转染p EGFP-N3-Exon2组和共转染p EGFP-N3-Exon2和p Silencer 3.1组细胞的荧光强度明显减弱（P<0.05）。5.CCK8结果显示:对比Blank组,转染后1d后si-lnc RNA组和RGMB过表达组细胞的增殖能力均出现明显抑制（P<0.05）,并且随时间的延长抑制作用日益显著。该两组之间细胞的增殖能力变化无显著差异（P>0.05）。6.流式细胞术检测细胞周期结果显示:比Blank组细胞,si-lnc RNA组和RGMB过表达组细胞在G0/G1,S和G2/M期的比例发生变化,处于G0/G1期比例均显著升高,而处于S期的比例显著降低（P<0.05）,该两组之间相比无显著差异（P>0.05）7.Transwell实验结果显示:对比Blank组,si-lnc RNA组和RGMB过表达组细胞的侵袭能力均出现明显抑制（P<0.05）,且比较两组之间细胞的侵袭能力变化结果无显著差异（P>0.05）结论1.lnc RNA芯片检测分析得到肺腺癌组织标本中差异表达的lnc RNAs有907个,其中272个（约30%）表达上调,635个（70%）表达下调。lnc RNARGMB-AS1在肺腺癌组织中表达增高,其表达水平与患者的肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移有相关性。2.体内外下调肺腺癌细胞中的lnc RNARGMB-AS1表达可有效抑制肺腺癌细胞的生长、抑制细胞侵袭迁移能力。3.Lnc RNA RGMB-AS1通过负调控RGMB的表达,从而发挥相应的生物学功能。4.Lnc RNA RGMB-AS1发挥促癌作用,有望成为肺腺癌治疗新的靶点。