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糖核苷酸是生物体内用于糖基转移反应的糖供体底物,在糖生物学和糖生物工程方面都有重要的研究应用价值。木糖(xylose,Xyl)是构成生物体内糖链结构的重要单糖组分,含有木糖的糖类物质已经被证实具有很多重要的生物学功能,如动物中木糖参与构成的糖胺聚糖参与了细胞增殖、迁移、粘连、胞间通讯、肿瘤细胞生长及病原体入侵等事件的发生,而植物和细菌中木糖则广泛参与构成细胞壁及胞外多糖组分,因此研究糖类物质的木糖糖基化合成的生物学意义不言而喻。UDP-木糖(UDP-Xyl)是用于Xyl单糖糖基转移的糖核苷酸供体。在生物体糖核苷酸合成通路中,UDP-Xyl由UDP-xylose synthase(UXS)催化UDP-GlcA脱羧反应生成,而UDP-GlcA则由UDP-glcose dehydrogenase(UGD)催化UDP-葡萄糖(UDP-Glc)脱氢转化生成。用生物酶工程手段合成相关糖核苷酸产物具有易操作、成本低、产物纯、产量高的优势,但其依赖于具有高性能的生物酶。由于UDP-Glc容易获得且比较廉价,因此本论文以UDP-Glc到UDP-Xyl的合成通路中的两种酶UGD和UXS为研究对象,挖掘具有耐高温特性的酶并研究其酶学特性及在UDP-Xyl合成中的应用效果。本论文从嗜热菌Rhodothermus warinus(R.marinus)中发掘到两个UGD(RmUGD1和RmUGD2)和一个UXS(RmUXS)酶蛋白基因,研究发现RmUGD1和RmUXS具有高催化活性、耐高温等特点,适合于UDP-GlcA和UDP-Xyl的生产应用,在基础研究领域,RmUXS是首次从嗜热菌中发现的UXS基因。具体研究成果如下:1.RmUGD1、RmUGD2与RmUXS的克隆表达与序列分析从R.marinus基因组中发掘并克隆了两个UGD基因和一个UXS基因,分别命名为RmUGD1、RmUGD2和RmUXS。氨基酸序列同源分析表明这三个基因的氨基酸序列同其他物种中同源基因序列间有很高的保守性,部分序列相似度可达50%以上,但RmUGD 1和RmUGD2之间的保守性仅有29%。蛋白结构域分析发现RmUGD 1和RmUGD2都含有两个分别位于蛋白序列N-端和C-端的SDR结构,但RmUGD2和RmUGD1相比缺少了N端的UDPG-MGDP-dehydrogenase结构域。RmUXS含有一个典型的加长版的SDR结构,包含一个结合NAD+的结构域(NAD+ binding site),和两个底物结合结构域。RmUGD1、RmUGD2和RmUXS三个基因所表达蛋白质均不含信号肽序列和跨膜结构区。2.RmUGD1、RmUGD2和RmUXS的体外原核表达及其重组酶活性的检测RmUGD1、RmUGD2和RmUXS在大肠杆菌BL-21菌株体外表达和纯化后经SDS-PAGE电泳检测,均得到了与理论值相同大小的条带。UPLC对酶催化反应产物分析结果发现RmUGD1催化UDP-Glc生成了UDP-GlcA,而RmUGD2没有催化生成UDP-GlcA,RmUXS催化UDP-GlcA生成了UDP-Xyl且该反应无需添加外源NAD+。由于该类酶的耐高温特性,简单的高温加热法具有和镍柱法相同的蛋白纯化效果。核磁共振(NMR)和MALDI-TOF的检测进一步验证了RmUXS的反应产物。NMR实时检测表明产物UDP-Xyl随反应时间不断增加,而底物UDP-GlcA则随反应的进行而不断减少,10分钟后底物被完全转化。MALDI-TOF检测结果同样证实了反应产物UDP-Xyl的生成。3.原核重组表达RmUGD1的酶生化特征的测定用体外酶催化反应的测定结果表明,重组的RmUGD1的最适pH值为9.0,最适反应温度为60℃,不需要金属离子作为辅酶。Zn2+和Co2+抑制RmUGD1酶活性,Mg2+对RmUGD1有促进作用,而Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、MTn2+和Ni2+对RmUGD1均没有明显的影响。100mM和250 mM的NaCl对RmUGD1活性有轻微的促进作用,但当NaCl浓度高于250 mM时,RmUGD1的酶活会受到抑制。SDS可使RmUGD1完全失活,而Triton-X100可略微提升RmUGD1的酶活性。RmUGD1在70℃下较为稳定,但在80℃时极易失活。UDP-Xyl可以对RmUGD1产生反馈抑制作用。RmUGD1对NAD+的Km值为25μM,最大反应速率为3.3μM min-1,Kcat值为0.032 min-1;对UDP-Glc的Km值为33μM,最大反应速率为3.4μM min-1,Kcat值为0.102 min-1。RmUGD1的酶的比活力为1.1U/mg。4.原核重组表达RmUXS的酶生化特征的测定用体外酶催化反应的测定结果表明,重组的RmUXS的最适反应pH为7.5,最适反应温度为60℃。RmUXS的酶活性也不需要任何金属离子的添加,Zn2+完全抑制RmUXS的活性,Ni2+、Co2+和Mn2+对RmUXS有抑制作用,而Ca2+、Fe2+和Fe3+可提升其酶活力,Mg2+和Cu2+对酶活性没有明显影响。RmUXS的耐盐能力较弱,从0.1 M起,RmUXS的酶活性便随着NaCl的浓度的上升而不断下降。UDP和UTP可强烈抑制RmUXS,使其酶活性下降至29%和26%,RmUXS在70℃下有很高的稳定性,而在80℃时极易失活。RmUXS对其底物UDP-GlcA的Km值为32μM,最大反应速率为10.2μM min-1,Kcat值为0.102min-1，酶的比活力为1.7U/mg。5.—釜法合成UDP-XylRmUGD1和RmUXS在一釜法试验中成功催化UDP-Glc生成UDP-Xyl,该反应中RmUGD1和RmUXS的最佳用量比在1:0.25-1:0.5范围间,反应最适pH为9.0,最适温度为60℃,正交试验获得的最佳反应条件组合为pH9.0,60℃,酶量比为1:1,三种因素pH对反应影响最大,温度次之。