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第一章非小细胞肺癌细胞株对顺铂及顺铂和Panobinostat联合用药的敏感性目的：在8个NSCLC细胞株中,检测各个细胞株对顺铂以及顺铂和Panobinostat联合用药的敏感性。方法：在8个NSCLC细胞株中,首先通过qPCR和Western检测ERCC1在各细胞株中的表达水平,然后分别用顺铂和顺铂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Panobinostat)处理,通过对细胞生长的测量观察不同细胞株对顺铂以及联合用药的敏感性。结果：在8个NSCLC细胞株中,我们检测到在细胞株A549, HCC827, NCI-H23, NCI-H441和NCI-H1975中,ERCC1匀为低表达；而在另外三个细胞株NCI-H1299, NCI-H2172和PC-14中,ERCC1为高表达。8个细胞株中,除了A549以外的7个细胞株均对顺铂耐药,与ERCC1的表达水平没有显著的相关性；而当顺铂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂Panobinostat和顺铂联用时,5个ERCC1低表达的细胞株中,4个细胞株均对联合用药敏感性显著增高,而3个ERCC1高表达细胞株对联合用药仍表现为不敏感。结论：ERCC1的表达水平对于NSCLC细胞株对顺铂单药的敏感性的预测并不明显；Panobinostat可以增加ERCC1低表达NSCLC细胞株对顺铂的敏感性。第二章ERCC1表达水平和p53状态对顺铂和Panobinostat联合用药疗效的预测作用目的：研究NSCLC细胞株中ERCC1表达水平和p53状态对顺铂和Panobinostat联合用药的预测性。方法：在ERCC1高表达的细胞株中进行ERCC1的敲低(Knockdown, KD)实验,同时选取2个ERCC1低表达细胞株进行ERCC1的过表达来验证ERCC1对顺铂和Panobinostat联合用药的预测性。通过敲低功能获得型(Gain of function, GOF)突变的p53,以及在p53缺失的细胞株中过表达野生型及GOF p53来验证p53状态对顺铂和Panobinostat联合用药的预测作用。最后在PC-14细胞株中,同时敲低ERCC1及GOF p53,观察细胞对顺铂和Panobinostat联合用药的敏感性的变化结果：在ERCC1高表达的细胞株NCI-H1299, NCI-H2172和PC-14中,敲低ERCC1可以增加NCI-H1299和NCI-H2172细胞株对顺铂和Panobinostat联合用药的敏感性。而在ERCC1低表达的细胞株HCC827和NCI-H23中,过表达ERCC1可以降低细胞对联合用药的敏感性。在携带GOF突变p53的细胞株NCI-H1975中敲低p53,在携带GOF突变p53和ERCC1高表达的PC-14细胞株中同时敲低ERCC1和p53可以增加细胞对联合用药的敏感性,而在野生型p53细胞株A549和HCC827中,则未观察到该现象；相反的,我们在p53缺失的细胞株NCI-H2172中,过表达野生型p53可以增加细胞对联合用药的敏感性,而过表达GOF突变p53则可以逆转该细胞中ERCC1敲低时细胞对联合用药敏感性的增加。结论：同时检测ERCC1的表达水平和p53突变状态可以预测NSCLC细胞株对顺铂和Panobinostat联合用药的敏感性。第三章Panobinostat可以增加顺铂诱导的细胞凋亡目的：进一步探讨Panobinostat对顺铂增敏作用的机制,从而深入了解ERCC1和p53预测NSCLC细胞株对两药联用的分子生物学基础。方法：通过qPCR检测p21的表达,western blot检测p53,磷酸化p53,cleaved-PARP的蛋白水平的表达,以及流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：在A549,HCC827和NCI-H23等三个ERCC1低表达以及不携带GOF突变型p53的细胞株中,联合应用Panobinostat较单用顺铂时细胞内磷酸化p53,p21和cleaved-PARP表达均显著升高,流式细胞仪检测PI/Annexin V显示细胞凋亡显著增高；而在携带GOF突变型p53的细胞株NCI-H1975和PC-14中,只能检测到磷酸化p53的增高,而不能检测到p21,cleaved-PARP等表达增高。在ERCC1低表达的NCI-H1975细胞株中,敲低GOF突变型p53后我们检测到cleaved-PARP表达增高以及流式细胞仪检测到凋亡细胞显著增加；在ERCC1高表达并且携带有GOF突变型p53的细胞株PC-14中,同时敲低ERCC1和GOF突变型p53时,也成功检测到细胞凋亡的显著增加。结论：Panobinostat可以通过增加顺铂诱导的细胞凋亡来增敏顺铂在NSCLC细胞株中的敏感性。实验目的：构建pET28a-HBVcAg-Mage A3质粒,并进行HBVcAg-Mage A3融合蛋白的表达和提纯。实验方法：构建pET28a-HBVcAg-Mage A3质粒,摸索HBVcAg-Mage A3融合蛋白的表达条件和纯化方法。实验结果：pET28a-HBVcAg-Mage A3质粒构建成功,HBVcAg-Mage A3融合蛋白的诱导表达优化后条件为细菌OD值摇至1.3-1.5左右,IPTG浓度1.0mM,10mM葡萄糖和100μg/mL Kan的LB液体培养基,再在23℃下摇床140rpm摇17小时,收菌并在冰上超声破碎菌体后SDS-page胶证实融合蛋白为内涵体,再用镍柱纯化和超滤脱盐。SDS-Page胶及BCA法测定提纯蛋白浓度。