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目的体外诱导人脐带华通氏胶间充质干细胞(Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJ-MSCs)向子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)和腺上皮细胞(endometrial epithelial cells,EECs)定向分化,探讨在分化过程中p38MAPK、ERK1/2以及cAMP-PKA信号通路的作用。方法(1)取足月剖宫产新生儿脐带华通氏胶,采用植块法原代培养WJ-MSCs。取全子宫切除术后新鲜子宫内膜组织,采用酶消化法原代培养ESCs。(2)采用8-溴-环磷酸腺苷(8-Br-cAMP)、雌激素及生长因子TGF-β,EGF,PDGF-BB诱导P3代WJ-MSCs向子宫内膜间质细胞样细胞分化,诱导21天后观察细胞的形态学变化,流式细胞术鉴定细胞表面波形蛋白、角蛋白表达情况。(3)采用transwell共培养体系将WJ-MSCs与ESCs共培养,并加入雌激素及生长因子,诱导WJ-MSCs向子宫内膜腺上皮细胞样细胞分化,诱导21天后观察细胞的形态学变化,流式细胞术鉴定细胞表面波形蛋白、角蛋白表达情况。(4)取五组P3代WJ-MSCs,按如下方式培养:A组为诱导组;B组用p38MAPK通路抑制剂SB203580预处理WJ-MSCs一小时;C组用ERK1/2通路抑制剂PD98059预处理WJ-MSCs一小时;D组用cAMP-PKA通路抑制剂预处理WJ-MSCs一小时;E组为不诱导组。随后采用8-Br-cAMP以及雌激素、生长因子诱导A、B、C、D组WJ-MSCs向子宫内膜间质细胞样细胞分化,E组用同等体积低血清培养基培养。培养21天后,比较五组细胞形态变化;流式细胞术、Western Blot检测各组干细胞表面子宫内膜间质细胞标志物:波形蛋白、CD13及腺上皮细胞标志物:角蛋白、CD9的表达变化;ELISA检测诱导后干细胞是否表达间质细胞蜕膜化蛋白:催乳素(Prolactin,PRL)及胰岛素样生长因子结合蛋白1(Insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP1)。结果(1)植块法培养5天后WJ-MSCs从组织块周围爬出,呈短棒状、纺锤形。细胞在培养10天左右呈旋涡状排列,并于14天左右融合至80%。消化、传代后的WJ-MSCs增殖速度明显增快。流式细胞术检测细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD79a及HLA-DR表达阴性。(2)胶原酶消化法培养的ESCs在接种后30分钟开始贴壁,细胞呈梭形或多角形,排列呈束。流式结果提示ESCs表面波形蛋白、表达阳性,角蛋白表达阴性。(3)采用8-Br-cAMP、雌激素及生长因子诱导WJ-MSCs21天后,细胞体积变小,细胞表面波形蛋白~+且角蛋白~-率和CD13~+且CD9~-率明显增高,细胞高表达PRL及IGFBP1,提示WJ-MSCs向子宫内膜间质细胞样细胞分化。(4)流式及Western Blot结果显示:8-Br-cAMP及雌激素、生长因子诱导组(A组)与未诱导组(E组)相比干细胞表面子宫内膜间质细胞标志物表达明显增加,腺上皮细胞标志物表达降低;抑制cAMP-PKA通路后诱导组(D组)细胞标志物的表达情况接近未诱导组(E组);而抑制p38MAPK、ERK1/2通路后诱导组(B、C组)细胞上述检测结果均接近诱导组(A组)。ELISA结果显示:A、B、C组干细胞高表达PRL及IGFBP1,而D、E组表达较低。(5)WJ-MSCs与ESCs共培21天后,细胞形态无明显改变,细胞表面角蛋白~+且波形蛋白~-率和CD9~+且CD13~-率均接近未分化组。结论(1)WJ-MSCs在8-Br-cAMP及雌激素、生长因子诱导下能够在体外分化为子宫内膜间质细胞样细胞,分化后的细胞波形蛋白~+且角蛋白~-率和CD13~+且CD9~-率明显增高,细胞高表达间质细胞蜕膜化蛋白:PRL及IGFBP1。(2)cAMP-PKA信号通路介导WJ-MSCs分化为子宫内膜间质细胞样细胞的过程,p38MAPK、ERK1/2通路在此过程中发挥的作用不明显。(3)WJ-MSCs在与ESCs共培21天后未向子宫内膜腺上皮细胞样细胞分化,相关诱导方法有待进一步研究。