花生四烯酸(ARA)是人体一种必需的多不饱和脂肪酸,它不仅在营养代谢中起重要作用,而且还被广泛应用于医药、食品和饲料等各种领域,有着广阔的应用前景。但是传统的发酵工艺并不能满足日益增加的市场需求,需要从分子水平进行改造以提高ARA的发酵生产水平。　　 本文首先以高山被孢霉的总RNA为模板,通过PCR反转录技术扩增出高山被孢霉延长酶基因(GLELO),将其克隆到simple T Vector,构建重组质粒T-GLELO。由于GLELO序列上有含有BamH I酶切位点,与要插入pD4质粒所用酶切位点一致,需敲除GLELO因上的BamH I酶切位点,实验在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下,选取370,371和372这3个碱基(GGG)所编码的Gly进行定点突变将其突变成GGT(Gly)。酶切鉴定和测序结果均表明定点突变成功,得到重组质粒T-GLELO*。　　 其次,为了使高山被孢霉的延长酶基因实现同源表达,必须在GLELO*上下游加入高山被孢霉能识别的启动子his H4.1p和终止子trpCt。实验以pD4质粒为模板,通过PCR扩增出his H4.1-hpt-trpCt片段,并克隆到simple T Vector,得到重组质粒T-his H4.1-hpt-trpCt。再将重组质粒T-his H4.1-hpt-trpCt上的潮霉素基因(hpt)替换成经过定点突变的延长酶基因(GLELO*),获得重组质粒T-his H4.1-GLELO*-trpCt。最后将his H4.1-GLELO*-trpCt片段再插入到pD4质粒中,获得重组质粒pD4-GLELO*。　　 此外,实验对高山被孢霉原生质体的形成因素和重组pD4-GLELO*的转化效率进行了考察。结果表明,采用总酶浓度为8 mg/mL,蜗牛酶和纤维素酶1∶1的比例的酶解液在25℃下酶解菌龄为3 d的菌丝3 h后,回收原生质体溶解于以1 mol/L的山梨醇为稳定剂的磷酸盐缓冲液中,可获得最大的原生质体产量4.16×107个/mg;采用线性化的重组质粒和聚乙二醇PEG4000来介导转化,原生质体转化率最高为1.8个/μg。　　 最后,实验对转化成功的高山被孢霉重组菌株进行了初步的摇瓶培养和发酵罐实验。摇瓶实验结果表明,重组菌株与野生型菌株在生物量和总油脂产量方面没有较大区别,但是ARA的产量由3.2 g/L提高到了4.2 g/L,且ARA占总油脂的比例提高了近10％。发酵罐实验结果表明,高山被孢霉重组菌株的生物量可达48 g/L,油脂和ARA的产量分别为17.3 g/L和7.9 g/L,ARA的产量比野生菌株中的产量提高了22％