论文部分内容阅读
植物双生病毒是一类在世界范围内广泛发生,造成经济作物产量严重损失的单链DNA病毒。本课题利用菜豆金色花叶病毒属双生病毒,中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)作为研究对象,通过遗传学、生物化学和分子生物学等手段对其卫星DNA(Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)编码的βC1蛋白在病毒侵染植物过程中的功能进行深入的探究。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-acticvated protein kinase,MAPKs)是一类真核生物中普遍存在的丝/苏氨酸蛋白激酶,由此形成的MAPK级联途径是真核生物中保守的信号传导方式,其主要作用是将外界刺激信号传入细胞内,使细胞及时作出有效的应答反应。本课题首先利用免疫沉淀的方法富集在本氏烟中瞬时表达的βC1蛋白并进行质谱分析,在βC1蛋白复合物中检测到7条匹配本氏烟MAPK激酶NbSIPKK的肽段序列,覆盖蛋白6个区域共14.4%的序列。以NbSIPKK在模式植物拟南芥中的同源物MKK2进行进一步分析,通过酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀和互补荧光素酶的方法鉴定并验证了 βC1与MKK2蛋白的互作,互作区域为MKK2的激酶功能域。体外磷酸化实验发现MKK2不能够磷酸化βC1,而βC1能够抑制MKK2的激酶活性。同样的,也利用酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀和互补荧光素酶的方法鉴定到βC1能和MKK2下游的MPK4蛋白互作,并也能够在体外实验中抑制MPK4的激酶活性。此外,利用细菌鞭毛蛋白的保守肽段flg22处理过表达βC1转基因拟南芥后发现,βC1能够抑制flg22诱导的MAPK激活,胼胝质积累和下游报告基因的转录。同时,转录组结果也显示,βC1在总体上对flg22诱导上调和下调的基因转录均存在负调控的作用。在mkk2突变体拟南芥里βC1便不能够再进一步影响flg22诱导的MAPK激活和下游报告基因的转录,说明靶标MKK2蛋白对于βC1抑制flg22诱导的MAPK激活是必须的。另一方面,TYLCCNV的侵染能诱导本氏烟MAPK途径中SIPK的激活,利用三种不同双生病毒感染本氏烟的病毒粒子粗提液处理拟南芥也能够激活拟南芥MAPK途径中MPK3和MPK6的磷酸化,说明MAPK途径参与对双生病毒侵染的防御。对野生型拟南芥和mkk2突变体拟南芥进行TYLCCNV+TYLCCNB侵染实验后发现mkk2突变体拟南芥的病毒侵染率要高于野生型。利用Crispr/cas9 技术敲除本氏烟 NBSIPKK 和 NBMPK4 基因的nbsipkk-crispr、nbmpk4-crispr突变体植株对TYLCCNV+TYLCCNB侵染均表现出更高的病毒积累量和更明显的病毒表型,说明MKK2和MPK4参与了对双生病毒的防御过程,TYLCCNV单独侵染后nbsipkk-crispr、nbmpk4-crispr表现出典型的卷叶、矮化的症状,说明βC1蛋白通过靶标MAPK途径中MKK2和MPK4来抑制MAPK介导的防御有助于病毒在植物体内的积累。本研究成果揭示了一种新的植物抗病毒的机制,也发现了双生病毒诱导症状产生的新的分子机理,为农业生产中有效准确的防控双生病毒提供了新的理论基础。