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7-脱氢胆固醇(7-DHC)作为合成维生素D3的重要前体,有着广泛的医药和临床应用。本研究将外源基因C-24还原酶(DHCR24)导入酿酒酵母中,成功实现了7-脱氢胆固醇的异源合成。将功能外源基因C24位双键还原酶DHCR24分别导入固醇C-24甲基转移酶(ERG6)或固醇C-22脱氢酶(ERG5)的单敲酵母菌株中,结合内源tHMGR的过表达来增加前体量,最终可获得7-DHC的人工生产菌株。外源基因DHCR24模块的导入实现了产物的从零到有。上游内源基因tHMGR基因的过表达虽然会导致鲨烯的大量积累,但会给后续固醇合成提供前体物,使产量大幅提高。敲除ERG6的菌株较ERG5敲除菌株而言,虽然生长趋势略差但会直接增加代谢底物酵母固醇的积累,使固醇整体水平处于较高状态,利于产物生成。最终底盘细胞与内外源模块相互配合,使得人工合成菌株的产量为3.4mg/L。进一步针对7-DHC合成路径中的后鲨烯路径内源基因进行比较,用固醇类物质的变化来研究7-DHC合成路径的内源关键基因。发酵结果表明,后鲨烯路径内源基因ERG2-ERG3的联合过表达使得7-DHC的产量有略微提高。原因在于ERG2-3位于酵母固醇的下游,对7-DHC的合成起了推动作用。通过产物差异性的比较,推断了一系列未知的固醇类物质,证明了DHCR24的底物非特异性。各类物质相对含量的变化证实了后鲨烯路径内源基因模块对整体固醇相对含量的变化及固醇总量的调节作用,结合PCA分析后,得出一致性结论:调节后鲨烯路径基因模块会引起明显的固醇成分差异,但其中最显著影响的是ERG11单基因模块和ERG2-3组合模块。ERG11和ERG2-ERG3是7-DHC合成路径上的关键基因模块。针对生物体内底物复杂,产物生成后分离纯化困难等问题,探索体外生物反应体系。首先以两个已知外源基因LXYL-P1-2和DBAT为例,试验PURE System无细胞转录/翻译偶联体外表达体系。DNA片段加入体系后成功检测到了各蛋白的表达。同时,将两基因在大肠杆菌中表达,之后直接利用细胞裂解液来进行酶促反应。DBAT作用后产物bacatinIII的生成证明了体外酶促反应的可实施性,间接为之后固醇类及其他天然产物的合成提供了新的反应方式。