【摘 要】
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早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是危害女性生殖内分泌健康的常见妇科疾病之一。POI的实质是各种因素作用导致的卵泡闭锁加速至提前耗竭,而卵巢颗粒细胞(granulosa cells,GCs)的凋亡是卵泡闭锁的始动因素,研究表明氧化应激(oxidative stress,OS)与POI及GCs的凋亡密切相关。OS是指体内氧化和抗氧化系统二者之
【基金项目】
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2017年广东省科技计划重点项目(2017A020214012); 2019年广东省自然科学基金面上项目(2019A1515010452);
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早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是危害女性生殖内分泌健康的常见妇科疾病之一。POI的实质是各种因素作用导致的卵泡闭锁加速至提前耗竭,而卵巢颗粒细胞(granulosa cells,GCs)的凋亡是卵泡闭锁的始动因素,研究表明氧化应激(oxidative stress,OS)与POI及GCs的凋亡密切相关。OS是指体内氧化和抗氧化系统二者之间的平衡状态被打破,致使活性氧(reactive oxygen species,ROS)异常升高,高ROS水平诱导线粒体DNA改变并导致线粒体功能障碍,从而损害卵子发生,促使GCs加速凋亡,影响胚胎质量,最终导致女性生育能力下降。本课题组前期利用外显子测序技术在10例散发的POI患者中,筛查出12个基因,包含22个突变位点,作为POI的候选致病突变。随后在20例扩大的POI样本中进行Sanger测序验证。结果,基因突变SCUBE1(c.1169C>G,p.P390R)被证实在20例的POI样本中突变频率为0.15。研究显示,SCUBE1参与了炎症反应、细胞增殖修复等多种病理生理过程,而OS在上述过程中均扮演了重要的角色。然而,目前尚不清楚SCUBE1是否能保护人GCs免受OS损伤。利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)体外诱导卵巢GCs氧化损伤以引起细胞凋亡是一个较常用且合理有效的探索影响卵泡发育、卵巢功能相关因素及机制的方法,借此分析SCUBE1在人GCs凋亡中的作用,为POI的防治提供新的思路,为POI进一步研究提供科学的理论和实践依据。目的探索SCUBE1蛋白在人和小鼠卵巢上的表达规律。探讨SCUBE1在保护人GCs免受H2O2诱导的细胞凋亡中的作用和机制。方法首先通过qRT-PCR、western blot和免疫组化法分析SCUBE1在不同年龄段的人和不同周龄的小鼠卵巢上的表达规律。随后,用SCUBE1重组蛋白对H2O2处理的GCs进行预处理。用CCK-8法检测细胞的活力和增殖。用流式细胞仪结合DCFH-DA和罗丹明123分别测定ROS和线粒体膜电位水平。用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒测定细胞的凋亡比。通过western blot测定通路相关蛋白的表达水平。最后基于软件分析SCUBE1基因点突变前后生物信息学变化。结果SCUBE1蛋白主要分布于卵巢中央的髓质区,于血管腔内及血管丰富的周围区域有较强的表达。体外细胞实验表明,SCUBE1预处理后可以降低H2O2诱导的细胞凋亡、提高细胞活力。SCUBE1还能够阻碍细胞内ROS的产生,改善线粒体膜电位。SCUBE1预处理后上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达的同时下调Bax、Bax/Bcl-2、Caspase-3和p53促凋亡蛋白的表达。此外,还能减弱p38 MAPK、JNK蛋白的表达,增强ERK1/2的表达。最后,从突变致病性、蛋白稳定性、基因单倍剂量不足等方面分析SCUBE1(c.1169C>G,p.P390R)突变的影响,大量的数据表明p.P390R突变致病性显著。结论SCUBE1通过降低ROS的产生和提高线粒体膜电位、上调抗凋亡蛋白和下调促凋亡蛋白的表达来保护GCs免受H2O2诱导的损伤。
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