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研究目的
1.建立稳定、可靠的脑出血模型,为进一步研究脑出血的神经功能恢复和治疗效果奠定基础；同时探讨脑出血后脱髓鞘病变的病理变化。
2.从人脐索中分离、培养、传代并鉴定间质干细胞,为将来开展干细胞的治疗创造条件。
3.运用慢病毒载体将HGF转染间质干细胞,建立高效、稳定表达HGF基因的人脐带来源的间质干细胞,为疾病的基因和细胞的联合治疗打下基础。
4.观察HGF转染的间质干细胞和单纯间质干细胞移植治疗脑出血的神经功能改善情况,探讨HGF和间质干细胞发挥神经保护作用的可能机制,为脑出血等神经系统疾病的治疗提供新的治疗手段。
研究方法
1.健康SD雄性大鼠50只,鼠龄约12周,重220克。随机分为脑出血模型组和假手术组(各20只)、正常大鼠组(10只)共三组。通过注射Ⅳ胶原酶至大鼠内囊处诱导脑出血大鼠模型,假手术组注射等量的PBS。运用rotarod test和mNSS功能评分分别于造模型术前1天、术后1、7、14、21、28、35天进行神经行为学功能检测大鼠的神经功能损害情况。H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI检测脑组织的病理变化；分别用免疫组织化学染色和Western blot蛋白定量分析检测髓鞘碱性蛋白(myelin basicprotein,MBP)、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和生长相关蛋白(growth-associated protein-43,GAP-43),评价脑出血后的病理改变和神经纤维的脱髓鞘病变情况。
2.在征得胎儿父母同意后,取产后脐带用于间质干细胞(MSC)的分离和培养。采用酶消化法分离、DMEM中培养间质干细胞,并进行传代。观察细胞的形态学,通过流式细胞仪检测细胞表型鉴定间质干细胞。
3.通过慢病毒载体系统(pWPI、pAX2和MD2G)将hHGF基因转染人脐带MSC。将hHGF基因克隆至pWPI载体的PMEI酶切位点,再将转染基因的pWPI和pAX2、MD2G一起感染293T细胞获得重组慢病毒,再转染hUCMSC,获得转染HGF的间质干细胞。荧光显微镜下观察GFP的表达评价转染效率。Western blotting和ELISA检测基因转染后的细胞上清液的hHGF的含量。
4.80只SD雄性大鼠(220g,鼠龄12周),随机分为HGF.MSC、MSC、PBS和正常组,每组20只大鼠。脑出血模型后7天分别于出血对侧脑室在立体定位仪下缓慢注入等容量HGF-MSC、MSC、PBS,含细胞数为6×105。分别于造模型术前1天、术后1、7、14、21、28、35天进行神经行为学功能检测神经功能恢复情况。Luxol fast blue染色观察脑组织的神经纤维改善情况；分别用免疫组织化学染色和Western blot蛋白定量分析检测MBP、MAG和GAP-43的变化,评价经过细胞移植和基因治疗后脑出血后的神经纤维髓鞘再生情况,探讨其对神经再生的可能作用机制。
研究结果
1.成功建立脑出血模型,胶原酶诱导脑出血模型后大鼠表现明显的神经功能障碍。模型建立后,H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI检测发现脑损伤区出现脱髓鞘病变等脑出血病理改变。免疫组织化学和Westernbloting检测发现,MBP和GAP-413的表达在脑出血后较对照组明显减少,而MAG的表达在出血后升高。
2.从人脐带成功分离、培养到间质干细胞。细胞呈长的扁平的梭形,细胞形态细长,类似成纤维细胞,具有干细胞的形态特征。流式细胞仪免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD166阳性表达达96.3％以上,而HLA—DR、CD3、CD16、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45和CD133等呈阴性表达,符合间质干细胞的表型特征。
3.慢病毒载体系统成功转染HGF至MSC。荧光显微镜下观察HGF的转染效率高达80％。Western blotting和ELASA检测转染细胞后上清液的HGF含量显著高于未转染基因者,获得HGF在间质干细胞的高效表达和分泌。
4.脑出血模型后hUCMSCs-HGF组的神经功能恢复较hUCMSCs和PBS组明显提高,hUCMSCs-HGF组的神经纤维修复达较其它组明显改善。免疫组织化学和Western bloting结果显示,转基因组的MBP和GAP-43的表较其它组表达增强,而MAG表达减弱。
结论
1.脑出血后神经功能的缺失与脑损伤后脱髓鞘病变有关,MBP、GAP-43和MAG是反映脑出血后神经纤维退行性变的敏感标志物,这可以为作为将来的治疗观测指标和靶点。
2.人脐索可成功分离、培养而获得间质干细胞。通过慢病毒载体系统转HGF基因hUCMSC后可获得HGF的高效表达和分泌,为神经系统等疾病的治疗提供良好条件。
3.本实验说明ICH神经功能的改善与神经纤维的修复相一致,提示神经纤维是一种新的治疗靶相,也为药物治疗指明了方向。
4.HGF可以促进神经纤维的再生,是治疗神经系统疾病神经缺失的有效营养因子。转HGF的MSC的治疗作用至少部分是通过上调MBP和GAP-3、下调MAG来促进神经再生的。通过本实验的研究将HGF基因转染hUCMSCs对治疗神经功能疾病行之有效,提供了治疗的新手段和思路。