禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis)是由C型逆转录病毒禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一系列症状的总称,主要包括矮小综合征、急性网状细胞瘤和慢性组织肿瘤;其病原是目前己知的家禽中第三种肿瘤病病原。目前用于REV检测的方法虽然灵敏度高、准确性强,但耗时长,需要专业人员和专业设备,基层推广条件不理想。为此,需要一种简便快捷的检测方法来检测REV。本论文设计研制了一种以检测REV主要免疫原性蛋白p30的两种单抗,REVp30-2C8、REVp30-5G6为基础的免疫胶体金层析试纸条,具有良好的特异性,灵敏度和ELISA试剂盒相当,且快速、灵敏、准确,5-15min即可出结果;检测样本涵盖肛拭子、喉拭子等,采样方便,不需专业设备;成本低廉且具有良好的基层推广价值,在生产实际中将产生重要作用。1.两种单克隆抗体与胶体金结合条件的选择本研究参考Frens控制还原剂量以控制胶体金粒径大小的方法,成功制备了粒径为15nm、30nm、40nm的胶体金,通过肉眼观察,透射电镜,胶体金试验的方法鉴定其适用性。而后,使用本实验室制备的两株检测REVp30蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,经由balb/C小鼠制备腹水,Protein G纯化柱纯化两株单克隆抗体REVp30-5G6、REVp30-2C8,进行这两种单克隆抗体与特定粒径胶体金颗粒结合最佳条件如最佳结合pH,最佳结合蛋白量的选择。经电镜鉴定,并结合蛋白使用效率和实验结果,选择了 30nm胶体金颗粒作为结合颗粒。2.网状内皮组织增生症病毒抗原快速检测试纸条的研制及优化本研究研制了免疫胶体金层析试纸条,并优化制备了适应临床环境中的应用得试纸条。首先设计免疫胶体金试纸条,纯化C线IgG多抗,制备待检抗原;再对试纸条多种工艺指标进行优化,如胶体金试纸条中胶体金-抗体复合物最佳喷量,NC膜T线C线的处理等;最后检测制成的胶体金试纸条的灵敏度、特异性、重复性、保存期。最终选用以REVp30-5G6为金标抗体,REVp30-2C8为T线抗体的试纸条为最终产品,其REV最低检测限为195TCID50,灵敏度可以达到ELISA试剂盒检测的标准,与ALV、CAV、REV、MDV、IBDV无交叉反应,特异性、批间批内重复性良好。本试纸条不耐高热,需低湿度4℃环境保存。此条件下本试纸条可以保持最少12个月,该试纸条的灵敏度、特异性等性能无变化。3.REV抗原快速检测免疫胶体金层析试纸条的初步应用实验室条件下模拟SPF鸡感染REV病毒,对从感染病鸡采集的喉拭子、肛拭子等样本对其使用ELISA、CGIA、PCR和传统的病毒分离间接免疫荧光方法进行同步检测,结果相互印证,以验证本实验的临床应用前景。试验结果证明,本实验制备的免疫胶体金层析试纸条能准确、简便、快速的检测REV抗原,5-15分钟即可出结果,不需要专业的设备和技术,适用于基层兽医部门、家禽育种公司、疫苗生产企业以及出入境部门对禽网状内皮组织增生症病毒的快速检测,且成本低廉,经济效益良好。