过氧化氢是活性氧（ROS）重要组成部分，在如线粒体氧化代谢或外源性物质和细胞因子反应等广泛的生理过程中产生，同时也在许多疾病的发生发展中起着举足轻重的作用。近年来大量研究表明，在病理条件下，如辐照损伤造成的氧化应激水平升高，长期慢性炎症疾病的恶化，癌化，都会导致ROS的含量过度增加，而过度增加的ROS会促使生物分子被氧化，促使正常组织的氧化损伤、炎症和癌变程度的加重，造成一种恶性循环。但常用的小分子抗氧化剂存在许多缺陷，如无特异性分布、不稳定、循环半衰期短和诸多的不良反应，使其广泛应用受到限制。所以，研究活性氧响应性纳米抗氧化应激抗炎甚至抗肿瘤活性具有重要意义。　　为解决以上问题，本课题提出设想：以4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯为活性氧响应单元，将其键合于生物相容性环状分子β-环糊精（β-cyclodextrin,β-CD），得到了具有过氧化氢响应性的材料OxbCD，自组装形成纳米粒OxbCDNP，所制备的纳米粒能对过氧化氢响应，并且具有抗氧化应激抗炎的作用。进而通过负载模型药物伊立替康（Irinotecan，CPT-11）研究了载药OxbCDNP纳米药物在防治结肠炎介导的结肠癌中的有效性。结果表明，OxbCDNP和以其构建的纳米药物对结肠炎转结肠癌整个过程的炎性浸润和癌变都具有较好的治疗效果。　　1.活性氧响应性载体材料的合成与表征　　将β-环糊精用N,N-羰基二咪唑（CDI）在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中活化后，用乙醚沉淀，所得的白色粉末加入4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯溶于DMF，混合液用无水乙醚沉淀，即得活性氧响应性材料OxbCD。用核磁共振波谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和MALDI-TOF-MS对材料进行结构表征。　　2.活性氧响应性纳米粒的制备　　水相为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG，分子量2000）和卵磷脂，有机相为OxbCD，通过纳米粒沉淀/自组装法得到活性氧响应性纳米粒（OxbCDNP）。测定其粒径大小和表面电位，使用透射电镜（TEM）对纳米粒的形貌进行表征。　　3.活性氧响应性纳米粒水解性能评价　　在不同H2O2浓度或不同pH的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，分别加入5mgOxbCDNP，由紫外可见分光光度计测量其500nm处的透光率。　　4.活性氧响应性纳米粒体内外抗氧化应激性评价　　将RAW264.7巨噬细胞与纳米粒共孵育后，用X射线进行辐照，再加入活性氧荧光探针，通过流式检测细胞内过氧化氢的生成量；将RAW264.7巨噬细胞与纳米粒共孵育后，用X射线进行辐照，收集细胞，用凋亡试剂盒检测细胞凋亡数量。　　C57小鼠尾静脉注射不同剂量的纳米粒，分别在第1、7、28天处死小鼠，取全血检测血常规，取血清检测肝肾功，取28天后主要脏器做H&E染色切片。　　5.活性氧响应性纳米粒体内抗炎作用评价　　Balb/c小鼠左后侧足趾部位厚度测量后，在其足趾部位注射0.2%角叉菜胶溶液建立模型。0.5h给予OxbCDNP。6h后测量小鼠足趾厚度。然后在足趾部注射鲁米诺钠溶液，进行活体成像。　　6.活性氧响应性纳米粒的初步安全性评价　　体内细胞毒性评价。将小鼠巨噬细胞（RAW264.7），人结肠腺癌细胞（Caco-2）和小鼠结肠癌细胞（C26）与不同浓度的纳米粒溶液共孵育12或24h后，采用MTT法检测细胞存活率；将RAW264.7巨噬细胞与纳米粒共孵育后，加入活性氧荧光探针，在同一光学参数条件下用荧光显微镜观察其荧光发光强度。另外，将RAW264.7巨噬细胞与纳米粒共孵育后，收集细胞培养基，用过氧化氢ELISA试剂盒检测其H2O2的含量。　　体外急毒性评价。BALB/c小鼠称尾静脉注射500mg/kg，1000mg/kgOxbCDNP。14天后处死小鼠，测血常规，肝肾功，取主要脏器做H&E染色切片。另外，大鼠股四头肌注射25mgOxbCDNP。14天后处死大鼠，取注射部位组织做H&E染色切片和DHE切片。　　7.活性氧响应性伊立替康纳米药物的制备　　水相为DSPE-PEG（分子量2000）和卵磷脂，有机相为OxbCD和伊立替康，通过纳米粒沉淀/自组装法得到活性氧响应性伊立替康纳米药物（CPT@OxbCDNP）。测定其粒径大小和表面电位，使用透射电镜（TEM）对纳米粒的形貌进行表征。利用紫外分光光度计（UVSpectrophotometer）测其载药量。　　8.活性氧响应性伊立替康纳米药物的体外释放评价　　配置含或不含H2O2的pH1.0、pH6.4、pH7.4的PBS溶液以及模拟胃肠道酶环境的PBS溶液，将活性氧响应性纳米药物置于上述环境，在特定的时间取此配置液固定量。通过紫外分光光度计测量伊立替康的释放量。　　9.活性氧响应性伊立替康纳米药物体外细胞吞噬评价　　水相为DSPE-PEG（分子量2000）和卵磷脂，有机相为OxbCD和花青素染料5（Cy5），通过纳米粒沉淀/自组装法得到负载Cy5的纳米粒（Cy5@OxbCDNP）。将相同浓度纳米粒与C26结肠癌细胞共孵育不同时间或者将不同浓度纳米粒与C26细胞孵育同一时间后收集细胞进行流式分析，考察细胞对纳米粒吞噬的时间和浓度关系。　　10.活性氧响应性伊立替康纳米药物体外抗肿瘤活性评价　　将活性氧响应性纳米药物与C26结肠癌细胞共孵育后，收集细胞，用不同试剂盒进行流式检测，考察纳米药物对细胞凋亡、周期、DNA拓扑异构酶1的分泌、活化型半胱天冬酶-3和活化型核糖聚合酶生成的影响。　　11.活性氧响应性纳米粒对结肠局部的靶向性评价　　水相为DSPE-PEG（分子量2000）和卵磷脂，有机相为OxbCD和花青素染料7.5（Cy7.5），通过纳米粒沉淀/自组装法得到负载Cy7.5的纳米粒（Cy7.5@OxbCDNP）。Balb/c小鼠称腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷，连续服用一周2.5%葡聚糖硫酸钠溶液，随后给予两周正常饮用水，建立小鼠结肠癌炎症阶段模型。再口服给予Cy7.5@OxbCDNP6h后进行活体成像，考察纳米粒在结肠部位的靶向能力。　　12.活性氧响应性纳米粒在结肠癌炎症阶段的治疗效果评价　　Balb/c小鼠腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷，连续服用一周含2.5%葡聚糖硫酸钠溶液，随后给予两周正常饮用水，正常饮用水其间每天口服给予活性氧响应性纳米粒。经上述21天后，处死小鼠，取结肠拍照，做H&E染色切片和钙黏蛋白切片，并对结肠组织分泌的髓过氧化物酶和炎症因子进行检测，考察纳米粒在结肠癌炎症阶段的治疗效果。　　13.活性氧响应性伊立替康纳米药物对结肠癌的治疗作用评价　　Balb/c小鼠腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷，连续服用一周含2.5%葡聚糖硫酸钠溶液，随后给予两周正常饮用水，正常饮用水其间每天口服给予活性氧响应性纳米药物。上述21天为一个循环，共重复三个循环后处死小鼠，取结肠拍照，取结肠做H&E染色切片和TUNEL染色，并对结肠组织分泌的髓过氧化物酶和炎症因子进行检测，考察活性氧响应性纳米药物对结肠癌的治疗效果。　　14.活性氧响应性伊立替康纳米药物的初步安全性评价　　BALB/c小鼠口服给予1.5g/kg、3.0g/kg活性氧响应性纳米药物，两天记录一次体重，两周后处死小鼠，测血常规，肝肾功，取主要脏器做H&E染色切片，并统计脏器指数，考察口服纳米药物的安全性。　　1.基于β-环糊精和4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯合成了活性氧响应性材料OxbCD，并对其进行氢核磁共振谱、红外光光谱和质谱表征，核磁共振结果显示每个β-环糊精接上了5个4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯单元。使用纳米沉淀自组装法成功制备了活性氧响应性纳米粒OxbCDNP，其粒径分别为111.4nm，Zeta电位为-33.4mV。　　2.活性氧响应性纳米粒在PBS溶液中几乎不水解，而在双氧水中，水解速率随着双氧水浓度增大而增大。在同一双氧水浓度下，纳米粒在不同pH下水解效率不同，在酸性或在碱性环境水解速率缓慢，在中性环境有最好的水解速率。　　3.辐照实验结果显示，加入纳米粒进行保护后，RAW264.7巨噬细胞由辐照刺激所生成的ROS得到明显抑制，并且减少了细胞凋亡。在尾静脉注纳米粒后，辐照对小鼠血常规和肝肾功的影响最小。　　4.在小鼠足趾肿胀实验中，在给予纳米粒后，小鼠的足趾肿胀程度明显小于模型组，起到了缓解炎症的作用。　　5.成功制备了活性氧响应性伊立替康纳米药物CPT@OxbCDNP，其粒径为121.4nm，Zeta电位为-20.5mV，包封率为52.02%，载药量为14.5%。　　6.细胞吞噬的实验结果显示，C26结肠癌细胞对活性氧响应性纳米粒的吞噬随着浓度或时间的增加而增加。　　7.活性氧响应性伊立替康纳米药物的体外抗肿瘤活性结果表明，纳米药物能明显抑制C26结肠癌细胞的增殖，抑制C26细胞DNA拓扑异构酶1的分泌，同时促进C26细胞的活化型半胱天冬酶-3和活化型核糖聚合酶的生成。　　8.靶向实验的结果表明，口服Cy7.5@OxbCDNP后，活性氧响应性纳米粒能靶向结肠病灶部位。　　9.结肠癌炎症阶段的治疗效果显示，给予纳米粒后，结肠的长度，形态，组化切片均与正常组最接近，结肠组织中炎症因子TNF-α、L-1β和IL-6的含量，髓过氧化物酶的水平都显著性降低。　　10.结肠癌癌症阶段的疗效结果表明，给予纳米药物后，结肠癌变程度得到抑制，肿瘤个数显著低于模型组，并且从组化切片中可以看出纳米粒组的肠组织形态保护最为完整，同时结肠组织炎症因子和髓过氧化物酶的水平都显著降低。　　11.活性氧响应性纳米粒和纳米药物的初步安全性结果显示，活性氧响应性纳米粒对细胞无明显毒性和刺激性。小鼠急毒和大鼠肌肉刺激实验均表明纳米粒具有良好的体内安全性。活性氧响应性伊立替康纳米药物大剂量口服后，未见小鼠体重改变或者H&E组织染色切片有明显的病理变化。　　1.将4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯共价键合在β-环糊精上，合成了具有活性氧响应性的载体材料。并使用纳米沉淀/自组装法构建了活性氧响应性纳米粒，其形态为球行，粒径分布均一，带负电。　　2.活性氧响应性纳米粒能消耗辐照或炎症所引起活性氧过量增加，从而具有抗氧化应激和抗炎的作用。　　3.结肠癌细胞对活性氧响应性纳米粒吞噬具有时间和浓度依赖性，并且活性氧响应性伊立替康纳米药物能明显抑制结肠癌细胞的增殖、促进结肠癌细胞的凋亡，具有很好的体外抗肿瘤活性。　　4.活性氧响应性纳米粒能靶向到结肠癌病灶部位。且纳米粒可以在结肠癌炎症阶段产生显著的抗炎作用。而活性氧响应性伊立替康纳米药物可以有效的阻止结肠癌的癌变程度，具备显著的抗癌作用。　　5.活性氧响应性纳米细胞毒性较小，并且在动物急毒实验中对脏器组织没有明显损害，口服活性氧响应性伊立替康纳米药物也具有良好的安全性。　　综上所述，本课题基于β-环糊精和4-氨甲基频哪醇酯合成了活性氧响应性载体材料OxbCD，并以其负载抗癌药物伊立替康，制备了活性氧响应性伊立替康纳米药物CPT@OxbCDNP。该纳米粒具有抗氧化、抗炎的作用，并且能靶向到结肠癌病灶部位，被肿瘤细胞有效摄取。且在较高的活性氧环境中释放抗癌药物伊立替康，从而有效的靶向治疗结肠癌。因此，该活性氧响应性纳米粒有望作为一种预防和治疗氧化应激和炎症相关疾病的新型纳米载体。