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目的支气管哮喘是一种复杂的疾病,气道炎症反应和气道高反应性是哮喘的重要病理生理学特点。而气道炎症和高反应性是通过免疫细胞和神经细胞的双向信号调节完成的,故在哮喘的研究中寻找免疫细胞与神经细胞之间的双向信号分子成为焦点。研究表明神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是这一双向信号分子。而NGF发挥的多种生物学功能通常是通过与其高亲和力受体-酪氨酸激活酶受体A（trosine kinase receptor A,TrkA）结合后来来完成的。SH2-Bβ是位于细胞膜上的一种蛋白,研究发现它是TrkA的结合蛋白,NGF可以兴奋SH2-Bβ经SH2-Bβ的SH2-B区与TrkA相联系,使SH2-Bβ发生酪氨酸磷酸化,再作用于AKT/PKB,促使AKT/PKB进一步激活。但SH2-Bβ是否参与了哮喘的发病以及是否也是通过此传导途径起作用目前尚不清楚。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AMs）是联系免疫系统和神经系统的纽带。故以AMs为研究对象,探讨SH2-Bβ在AMs的表达以及是否通过NGF-TrkA-SH2-Bβ传导途径在哮喘中发挥作用,从而从细胞内生物信号传导角度阐明AMs在哮喘发病的分子生物学机制的作用,并为探讨哮喘治疗新的靶点及更有针对性地采取防治措施提供重要的科学依据。材料与方法1、哮喘豚鼠模型的制备清洁级健康雄性白化豚鼠60只,体重250-300g,随机分为5组:（1）PBS对照组（n=10）;（2）哮喘组（n=12）;（3）anti-NGF抗体组（n=14）;（4）anti-TrkA抗体组（n=14）;（5）布地奈德混悬液组（n=10）。实验第1天,（2）（3）（4）（5）组腹腔注射10%卵蛋白（ovalbumin,OVA）（含等量氢氧化铝凝胶）1ml,对照组（1）腹腔注射PBS1ml。第15天（2）（3）（4）（5）组进行超声雾化吸入0.5%OVA,每天一次,每次2～5分钟左右至喘息发作,共5天,但（3）（4）（5）组在吸入0.5%OVA前3小时分别给与anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体、布地奈德混悬液干预,每天1次,共5天。对照组用PBS超声雾化,时间同哮喘组。2、气道反应性测定最后一次吸入OVA 24小时内检测气道反应性,戊巴比妥腹腔注射麻醉,将对照组、哮喘组、布地奈德组豚鼠应用AniRes2005动物肺功能分析系统（北京贝兰博科技有限公司）检测气道阻力（包括吸气阻力和呼气阻力）。3、血管灌注,豚鼠处死,留取血清及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALA）和肺组织BALF细胞成分计数。ELISA法检测BALF上清中IL-4及IL-1β水平。各组肺组织HE病理检测。4、AMs的纯化BALF离心后沉淀细胞加入10%FCS-1640,放入培养瓶和事先放有盖玻片的24孔板内放入5%CO2孵箱内贴壁培养2小时。将24孔板内的盖玻片取出冲洗干净做免疫荧光染色和免疫细胞化学检测,培养瓶中贴壁的AMs用0.02%EDTA-Na2消化下后收集,—70℃冻存待测免疫印迹。5、HE染色观察肺组织病理学变化将各组豚鼠肺组织用石蜡包埋、切片（5μm）后,进行HE染色,光镜下观察并照相。6、荧光染色观察SH2-Bβ在对照组和哮喘组豚鼠AMs的表达将有AMs的盖玻片用4%多聚甲醛固定30分钟,PBS洗片后做SH2-Bβ荧光染色（TRITC-SH2-Bβ）。荧光显微镜观察并照相。7、免疫细胞化学染色检测AMs中SH2-Bβ、TrkA的表达取对照组、哮喘组、anti-NGF哮喘组、anti-TrkA哮喘组、布地奈德组AMs爬片,参照二步法免疫细胞化学试剂盒步骤测定SH2-Bβ表达情况。相同方法检测对照组、哮喘组、anti-NGF哮喘组AMs爬片的TrkA表达。8、Western blot检测AMs中SH2-Bβ、TrkA的表达、图像分析AMs中蛋白提取和定量后,取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳,经一抗和二抗孵育后显色,照相并分析。9、统计学分析所有原始数据采用SPSS11.5分析软件进行处理分析,所有结果均表示为平均值±标准差（（?）±SD）,样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法,正态分布及方差齐时,两两比较采用LSD检验;非正态分布采用秩和检验,P＜0.05为有差异显著性。实验结果1、哮喘豚鼠模型支气管肺组织病理检测:支气管肺组织病理学HE染色显示,可见对照组豚鼠支气管肺组织结构基本正常;哮喘组豚鼠气管管腔狭窄,气管壁内及管周以EOS、LC为主炎症细胞浸润,证实了本实验中豚鼠哮喘模型符合支气管哮喘。anti-NGF组、anti-TrkA组、布地奈德组模型的病理变化均较哮喘组有所减轻。2、气道反应性测定哮喘组豚鼠对Ach的浓度反应曲线明显上移,其呼气阻力及吸气阻力均较正常对照组明显升高（P＜0.01或P＜0.05）,表明哮喘实验模型成功建立。而给与布地奈德雾化吸入后,气道阻力较哮喘组明显改善。3、免疫荧光结果:在正常对照组豚鼠和哮喘组豚鼠支气管肺泡灌洗液AMs中均有SH2-Bβ的表达,且主要在细胞膜和细胞质上。并发现哮喘组的表达强于正常对照组。4、免疫细胞化学染色及分析正常对照组、哮喘组、anti-NGF哮喘组、anti-TrkA哮喘组及布地奈德混悬液组AMs中均有SH2-Bβ的表达,但强弱不同,哮喘组明显高于其他四组（P＜0.01）。TrkA蛋白在正常对照组、哮喘组、anti-NGF组豚鼠AMs中表达不同,哮喘组高于对照组及anti-NGF哮喘组（P＜0.01）。5、免疫印记（western blot）检测SH2-Bβ及TrkA的表达各组AMs中SH2-Bβ蛋白含量不同,哮喘组高于正常对照组、anti-NGF抗体组、anti-TrkA抗体组及布地奈德混悬液组（P＜0.01）。正常对照组哮喘组、anti-NGF哮喘组AMs中TrkA表达不同,哮喘组高于对照组及anti-NGF哮喘组（P＜0.05）。6、酶联免疫吸附实验检测豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β及IL-4的水平OVA致敏的哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-4的水平较正常对照组及布地奈德混悬液组升高,两两比较有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。结论1、SH2-Bβ在豚鼠AMs细胞中有表达,且哮喘组明显高于正常对照组,提示SH2-Bβ可能参与了哮喘的发病。2、在豚鼠哮喘模型的AMs中,NGF及TrkA可以调控SH2-Bβ的表达,而NGF又可影响TrkA的表达,提示SH2-Bβ可能是通过NGF-TrkA途径参与哮喘的发病。3、布地奈德混悬液可影响SH2-Bβ的表达,提示这可能是糖皮质激素治疗哮喘的另一途径。