论文部分内容阅读
关于成花机理的研究一直是植物发育生物学上的热点。黄瓜性别表现复杂多样,通常是雌雄异花同株,可以作为研究成花机理的良好的材料。CUM1是黄瓜的AGAMOUS同源基因,控制雄蕊和心皮的发育,研究其在黄瓜开花中的作用和对黄瓜性别分化的影响,有助于从分子水平上探究成花机理;钙离子也是植物成花过程中的一种重要的因子,本研究观察了黄瓜离体子叶节在花芽分化过程中细胞内钙离子的分布情况,以此来探究钙离子调控植物花芽分化的机理。主要结果如下:1.通过已知的黄瓜CUM1基因(AF035438)的序列设计引物,从黄瓜威势白峰品种的雄蕊RNA中克隆到了CUM1基因,与AF035438的同源一致性为99%,其ORF有819个核苷酸,编码273个氨基酸。将黄瓜(CUM1)、烟草(NAG1)、矮牵牛(FBP6/pMADS3)、番茄(TAG1)、百合(LLAG1)的AG同源基因的氨基酸序列进行多重比对,发现具有一个共同的保守区域,即MADS-box区。CUM1基因是黄瓜花器官特异性基因,仅在雄蕊中表达,而未见在花瓣、花萼及营养性器官中表达。2.分别构建了含CUM1基因的反义和正义的植物转基因表达载体,并对黄瓜进行遗传转化,从而研究CUM1基因在黄瓜中成花中的作用。利用pBluscript SK(+)(pBS)和pBIN19-35S-GFP两个载体,成功构建了反义表达载体pBIN19-35S-CUM1-GFP;同样,利用pd2EYFP-35S和pCAMBIA3300两个载体,成功构建了正义表达载体pCAMBIA330-35S-CUM1-GUS。3.将反义和正义植物转基因表达载体导入根癌农杆菌GV3101中,利用优化后的叶盘法进行黄瓜的遗传转化,确定诱导培养基为MS+BA2.0mg/L+ABA 1.0mg/L+AgNO3 2.0 mg/L,其中当AgNO3 2.0mg/L时能有效地提高农杆菌的转化效率。遗传转化反义基因表达载体pBIN19-35S-CUM1-GFP过程中,确定Kan抗性筛选压为75mg/L;遗传转化正义超表达载体pCAMBIA330-35S-CUM1-GUS过程中,确定PPT抗性筛选压为6mg/L。反义和正义转基因植株的诱导效率分别是75%(72/96)和69.8%(67/96),转基因植株PCR初步验证阳性转化株转化效率分别为40%(16/40)和43.8%(14/32),经PCR验证为阳性植株的进行Southern-blotting验证,共得到6株反义转基因植株和5株正义转基因植株,即实际转化率为15%(6/40)和15.6%(5/32)。半定量RT-PCR分析显示反义转基因植株中雄蕊中的CUM1 mRNA的表达量与野生型相比明显降低;正义转基因植株的花瓣、花萼、叶片均表达CUM1基因,而野生型在这三个器官中无表达。反义转基因植株表现为延迟开花,正义转基因植株中70.4%(38/54)的花表现为雄蕊退化,花的结构仅包括花萼和花瓣。4.通过焦锑酸钾沉淀法沉淀钙离子,对去顶后在诱导花芽和诱导营养芽培养基上的培养了0~14天的子叶节进行电镜观察,发现在花芽分化过程中细胞内存在一个钙离子流,即从细胞间隙中向细胞内流动,在胞质中发挥成花诱导作用,之后又重新向细胞间隙转移。去顶后0~1天的子叶节中Ca2+主要分布在细胞间隙;去顶后2~3天的诱花子叶节与诱芽子叶节相比,胞质内的钙离子颗粒明显多且大,4~7天钙离子逐步向胞壁和细胞间隙转移;8~14天诱花苗和诱芽苗子叶节中Ca2+分布的位置和密度均没有明显差异,因此去顶后2~3天可能是钙离子决定黄瓜花芽分化的关键时期。本研究从分子和生理两个水平上研究黄瓜花发育的机理,发现抑制CUM1的表达会使黄瓜延迟开花,而CUM1的超表达会使黄瓜花的雄蕊退化,提示CUM1基因可能参与花时基因的调控,是花器官原基发育的必需基因,建立的黄瓜遗传转化体系可用于研究其他相关基因对黄瓜成花的作用。还发现在花芽分化过程中细胞内存在一个钙离子流,去顶后2-3天的诱花培养基上的子叶节部位的钙离子大量定位于细胞质,而有研究发现去顶后3天是原基(二次突起)向花芽或营养芽方向发展的转折时期,则提示去顶后第2、3天为钙离子对黄瓜花芽分化的决定期,该研究结果为研究钙离子在黄瓜成花过程中的作用机理提供了基础。