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目的:从呼吸道感染的儿童患者中检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp),比较国内外检测Mp的主要方法,探讨儿童感染Mp的早期诊断。同时了解Mp临床株中大环内酯类耐药基因23S rRNA、核糖体蛋白L4和L22的突变情况,并采用PCR-RELP、套式PCR(Nested polymerase chain reaction, nPCR)和快速循环PCR(Rapid-Cycle polymerase chain reaction, Rapid-Cycle PCR)对Mp临床株的基因进行分型,比较三种应用于Mp分型的分子生物学方法的特点,以及在快速诊断、耐药监测和基因分型中的应用价值。方法:采集患有肺炎或有咳嗽、发热症状的呼吸道感染儿童的血清标本、咽拭子及肺泡灌洗液标本566份。采用特异性免疫凝集方法检测支原体特异性IgM抗体(Antibodies , Ab),并提取566份疑似Mp感染患儿咽拭子及肺泡灌洗液标本中的DNA,分别采用PCR和实时TaqMan荧光定量PCR (A quantitative real-time PCR , Real-Time PCR)检测标本中的Mp-DNA,并比较这两种分子生物学检测法与血清抗体检测方法对Mp感染患儿的检出情况。将临床咽拭子和肺泡灌洗液标本200例分别接种到支原体快速鉴定培养液与常规SP4液体培养液中进行培养,获取阳性临床株。同时设计引物PCR扩增Mp 23S rRNA基因Ⅱ区和V区、核糖体蛋白基因L4和L22,观察其突变情况。最后采用PCR-RFLP、nPCR分型分析以及Rapid-Cycle PCR对临床株的基因进行分型,观察这3种方法在基因分型中的特点。结果:566份受检患儿的血清标本中,Mp-IgM阳性285例(50.35%)。566份受检患儿咽拭子及肺泡灌洗液标本中(咽拭子508份,肺泡灌洗液58份),PCR法检测出Mp-DNA阳性45例(7.95%)。其中Mp-DNA阳性,血清Mp-IgM阴性20例(7.11%)。Real-Time PCR法检测出Mp-DNA阳性(定量结果≥1.00e+005copies/ml)175例(30.91%),其中Mp-DNA阳性,Mp-IgM阴性67例(38.28%)。200例快速培养和常规SP4培养法分离培养咽拭子及肺泡灌洗液标本中,快速培养法培养阳性标本35例(31.53%),经PCR及Real-Time PCR鉴定阳性标本3例(2.70%),假阳性32例(91.42%),经菌落培养鉴定为真菌占假阳性的93.75%(30/32)。常规SP4分离培养法培养阳性标本6例(4.95%),经菌落、PCR及Real-Time PCR鉴定结果一致率100%。其中咽拭子标本培养阳性4例,肺泡灌洗液标本培养阳性2例。24例Mp鉴定阳性临床株均存在23S rRNA耐药基因的碱基突变,14例(58.33%)存在核糖体蛋白L22碱基突变,6例(25%)存在核糖体蛋白L4碱基突变。其中,Mp 23S rRNA基因V区A2063G突变的临床株16例(66.66%),其次是Ⅱ区640位点A缺失14例(58.33%)、V区2471位点C缺失10例(41.66%)、Ⅱ区G759A突变8例(33.33%)。另外,Mp 23S rRNA基因中还存在A649 T突变、G2661C突变、A2635C突变、1957 A缺失、1974A缺失、1966 C缺失、2783 T插入等多个位点的突变、缺失和插入。Mp核糖体蛋白L4中,C162A、A430G突变的临床株4例(16.66%),一例C456T突变、一例A209T突变。Mp核糖体蛋白L22中, 498或499插入A的临床株11例(45.83%),其次是T279C突变3例(12.5%)。基因分型结果显示,45例Mp鉴定阳性临床株中,MpⅠ型21例(46.66%),MpⅡ型24例(53.33%)。Rapid-Cycle PCR分型分析与RFLP-PCR和nPCR相比,可以更快速更有效的对Mp-DNA阳性株进行分型。结论:1)实时TaqMan Real-timePCR技术弥补了血清学方法与PCR方法在临床应用中的缺陷,是一种特异性和敏感性都很高的技术。2)Mp临床株大环内酯类耐药最主要的突变是23S rRNA基因V区的A2063G突变、Mp核糖体蛋白L4的C162A、A430G的突变。3)Rapid-Cycle PCR是一种实用的分型鉴定方法,与RFLP-PCR、nPCR相比,可以更快速更有效的对Mp-DNA阳性标本进行分型。