刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）是一种在世界范围内给海水鱼类养殖业带来极大的危害和造成重大经济损失的寄生虫。目前对于刺激隐核虫病尚无有效的防治方案。研发刺激隐核虫病的疫苗可能是防治该寄生虫病的有效途径之一。但寄生虫在发育过程中其抗原组成会发生改变,增加了寄生虫疫苗开发的难度。DNA条形码如内部转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）是特定存在于每个物种的短DNA序列,利用CRISPR/Cas9技术精确地编辑这些条形码开发特定物种的抗寄生虫剂有可能克服这一难题。本文利用CRISPR/Cas9技术靶向刺激隐核虫的5.8S核糖体RNA基因（5.8S ribosomal RNA gene,也即5.8S rDNA）和物种特异的ITS-2序列,寻找有效的特异性的靶点位置,通过该靶点基因片段的破坏,影响刺激隐核虫的生存,甚至直接杀死刺激隐核虫。然后进一步将该系统整合到枯草芽孢杆菌中,拟通过该菌的表达系统分泌表达CRISPR/Cas9系统所需要的核心成分,使得该菌具备致死刺激隐核虫的作用,以利于口服药物的研发。本论文主要由五个部分组成:刺激隐核虫的体外培养;sgRNA（small guide RNA）的靶标选择、序列设计及正确性验证;相关sgRNA和Cas9mRNA的体外合成和转录以及在体外对刺激隐核虫进行浸泡实验;sgRNA加Cas9载体的构建;重组菌枯草芽孢杆菌SCK6的构建。本实验以刺激隐核虫的ITS-2和5.8S rDNA序列为靶目标,设计并筛选靶点sgRNA。体外测试中发现有两个靶点sgRNA分别和Cas9核酸酶的混合物能够有效地切割含有靶点序列的DNA片段。在此基础上,进一步的在体试验证实,相比对照组包囊的孵化率（87%）,暴露于Cas9 mRNA（与两种sgRNA单独或共同混合）能够显著降低刺激隐核虫包囊的孵化率,以ITS-2或5.8S rDNA为靶标的sgRNA暴露的孵化率分别为63%或66%;两种sgRNA共同混合Cas9 mRNA处理的孵化率约为62%。与对照组相比,经sgRNA处理的幼虫的存活率从70.7%降至27.3%（ITS-2）,27.7%（5.8S rDNA）和27.3%（ITS-2加5.8S rDNA）,三个实验组之间无显著性差异。实时定量PCR表明,无论是使用单一sgRNA还是混合使用两种sgRNA进行处理,三个实验组刚死亡幼虫的DNA均发生显著的破坏。DNA测序还显示在sgRNA靶向片段的DSB（DNA双链断裂:double strand break）位置前后,有碱基突变或缺失的现象,在两个靶点sgRNA同时作用时,两靶点中间的DNA有大片段的缺失。以上的结果表明,DNA条形码区域和5.8S rDNA序列在刺激隐核虫的生活史中均具有重要的作用都可用作开发抗寄生虫药物的靶标。DNA条形码区域可作为开发种类特异的抗刺激隐核虫RNA药物的靶标。枯草芽孢杆菌作为一种用于外源基因表达的安全宿主菌株,是受国际认证的非致病微生物,可作为表达RNA药物的宿主。为了使该研究尽可能地运用在实际生产上,借助枯草芽孢杆菌表达系统的不分泌内毒素及形成包涵体的优点,我们以整合载体pDGIEF为骨架,并融入了经筛选出来的有效靶点sgRNA、强启动子和Cas9片段重组成一个新的整合载体。借助新整合载体,将能靶向刺激隐核虫的完整CRISPR/Cas9系统整合到枯草芽孢杆菌染色体上,使得该系统能稳定的存在,避免了在实际生产过程中可能出现质粒丢失和抗生素基因在环境中扩散的问题。本项研究提供的原理和方法有助于开发刺激隐核虫或其他寄生虫疾病的新型核酸治疗药物,并为特定物种的抗寄生虫药物的开发提供了实验基础。